滇重楼品质评价及其甾体皂苷类成分积累规律分析

目的:探讨滇重楼居群内品质差异及甾体皂苷活性成分的积累规律,为该药材的品质评价及优质种质资源筛选提供实验依据。方法:采用超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)测定滇重楼居群内根茎、茎、叶中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的含量,建立各部位的UPLC指纹图谱,分析该药材居群内的品质差异及其甾体皂苷类成分的积累规律。结果:滇重楼居群内根茎和叶中总皂苷含量均0.6%,不同部位中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅶ含量具有显著性差异,而重楼皂苷Ⅵ含量无显著性差异;UPLC指纹图谱中5个共有峰为根茎、茎、叶共有,各部位共有峰UPLC指纹图谱相似度均0.753。结论:重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ主要在植物的叶绿体中合成并进行储藏和分配,经茎向下运输,主要在根茎和叶中积累和储存,总皂苷含量在不同部位的积累规律为叶根茎茎;滇重楼不同部位中主要活性成分含量及种类差异较大。     

多茎滇重楼不同部位甾体皂苷活性成分积累的研究

目的:探讨不同居群多茎滇重楼不同部位中甾体皂苷活性成分的积累。方法:采用HPLC法测定不同居群多茎滇重楼根茎,茎,叶中主要活性成分重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量,建立HPLC图谱,运用单因素方差分析、聚类分析和HPLC图谱分析探讨多茎滇重楼不同部位甾体皂苷活性成分积累的差异。结果:不同居群多茎滇重楼不同部位中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量及其总含量具有极显著(P0.01)或显著(P0.05)性差异,根茎中只有一个居群重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量未达到《中华人民共和国药典》(2015年版)0.60%的限量标准;根茎中重楼皂苷主要以Ⅰ、Ⅶ的形式存在,茎中只检测到重楼皂苷Ⅶ,叶中皂苷活性成分分布不规律;不同居群多茎滇重楼不同部位HPLC色谱图相似度均较高。结论:不同居群多茎滇重楼根茎中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量除一个居群外均达到国家限量标准,且不同居群多茎滇重楼不同部位中甾体皂苷活性成分差异较小。该研究为多茎滇重楼是否能够替代滇重楼入药提供了一定科学依据。     

生长年限对滇重楼中甾体皂苷活性成分和生物量积累的影响

目的 探究云南重楼Paris polyphylla var.yunnanensis（滇重楼）根茎中甾体皂苷活性成分和生物量积累随生长年限的变化状况,以期为滇重楼的质量控制提供科学依据。方法 以7、8、9、11、12、13、14、15年生滇重楼为研究对象,采用HPLC法和直接称重法测定不同年限滇重楼根茎中8种甾体皂苷（重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅲ、H、V和纤细薯蓣皂苷）含量和生物量。结果 8种甾体皂苷活性成分线性关系良好（R²≥0.999 5）,精密度、重复性、稳定性和加样回收率的RSD值均小于3%,验证了该方法的可行性;随着年限的增长,滇重楼根茎生物量呈逐渐增长的趋势,其生长发育可分为增长缓慢期（第1～4年）、增长快速期（第5～10年）和增长平缓期（第11年后）3个阶段,其中7年生滇重楼根茎生物量增长最快,平均年增长量达（31.843±14.225）g;滇重楼根茎中8种甾体皂苷成分含量在不同生长年限的变化呈随机波动、无规律,《中国药典》2020版规定的3个指标成分重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ含量之和与8种甾体皂苷总和的变化趋势一致;用4个主成分对不同年限滇重楼药材进行综合评价,结果显示7年生样品在所有样品中的综合得分位于前7名。结论 建立了同时测定滇重楼中8种甾体皂苷活性成分含量的方法,可用于滇重楼的质量评价;滇重楼并非种植年限越长越好,建议以7年生滇重楼采收入药为最佳。     

重楼皂苷Ⅰ、Ⅵ及总皂苷镇痛抗炎作用研究

目的:探讨重楼皂苷Ⅰ、Ⅵ及总皂苷镇痛抗炎作用。方法:采用小鼠热板法实验,小鼠醋酸扭体实验,二甲苯引起的小鼠耳肿胀炎症实验,角叉菜胶引起的小鼠足肿胀炎症实验。结果:重楼皂苷Ⅰ小、中、大剂量组给药后60、90 min能提高小组痛阈值,与空白对照组比较,有统计学意义(P0.05,P0.01);重楼皂苷Ⅵ小、中、大剂量分别于给药后90、60、30 min提高小组痛阈值,与空白对照组比较,有统计学意义(P0.05,P0.01);总皂苷大剂量给药后90 min能提高小组痛阈值,与空白对照组比较,有显著性差异(P0.05)。重楼皂苷Ⅰ、Ⅵ中和大剂量组的镇痛抑制率分别为28.16%、28.57%、25.71%、31.84%,和空白对照组相比,有统计学意义(P0.05)。重楼皂苷Ⅰ大剂量组、总皂苷中和大剂量组均能使小鼠耳廓肿胀度明显降低,抑制率分别为25.82%、30.22%、47.80%,其差异具有统计学意义(P0.01,P0.05)。重楼皂苷Ⅵ能减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀,作用不明显。重楼皂苷Ⅰ大剂量组、总皂苷中和大剂量组均能使小鼠耳廓肿胀度明显降低,抑制率分别为20.30%、27.82%、44.47%,其差异具有统计学意义(P0.01,P0.05)。重楼皂苷Ⅵ抗炎作用不明显。重楼皂苷Ⅰ大剂量组、总皂苷中和大剂量组能提高小鼠血清中SOD活力,和空白对照比相比,其差异具有统计学意义(P0.01,P0.05)。重楼皂苷Ⅰ大剂量组、总皂苷中和大剂量组能降低小鼠血清中MDA、PGE_2的含量,和空白对照比相比,其差异具有统计学意义(P0.05)。结论:重楼皂苷Ⅰ和Ⅵ具有较好的镇痛作用,重楼皂苷Ⅰ、Ⅵ比总皂苷作用强、起效快;重楼皂苷Ⅰ和总皂苷具有较好的抗炎作用,皂苷Ⅵ抗炎作用不明显。     

重楼皂苷类化合物溶血作用研究

目的 通过研究重楼皂苷类化合物的溶血作用,为重楼的进一步开发和利用提供依据.方法 以分离纯化获得重楼总皂苷、偏诺皂苷PHAC-A和薯蓣皂苷PHAC-B为实验材料,经梯度稀释后用常规肉眼观察法和分光光度法测定样品对兔血红细胞的溶血度.结果 当重楼总皂苷和(PHAC-A)在浓度大于等于50 μg·ml-1时、 (PHAC-B)浓度大于等于75 μg·ml-1时溶血率＞5%,3种样品的溶血作用均表现出剂量依存关系.结论 重楼皂苷中主要产生溶血作用的化合物为PHAC-A.重楼皂苷类化合物在特定浓度下不具有溶血作用,将其运用于静脉注射具有一定的可能性.     

UPLC-Q-TOF-MS/MS法结合网络药理学研究滇重楼抗肺癌活性成分

目的 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS法结合网络药理学研究滇重楼抗肺癌活性成分。方法 滇重楼70%甲醇提取物的分析采用ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8μm);流动相0.1%甲酸-乙腈;体积流量0.3 mL/min;电喷雾(ESI)离子源;负离子模式。通过网络药理学预测活性成分作用靶点、疾病相关靶点、成分-疾病-靶点相互关系,筛选调控疾病靶点的关键成分和相关作用靶点,并得到相关的调控通路。结果 滇重楼提取物中共鉴定出26个化合物,包括17个异螺甾烷醇型(9个薯蓣皂苷型、8个偏诺皂苷型)、1个螺甾烷醇型、1个C₂₁甾体化合物、2个黄酮类、1个其他类。活性成分进行靶点预测,与肺癌共性靶点91个。活性成分-靶点网络和肺癌靶点PPI网络分析表明,dioscinin、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅴ为滇重楼治疗肺癌的关键成分。重楼治疗肺癌KEGG分析发现,PI3K-Akt、Ras、MAPK等信号通路,为重楼活性成分调控肺癌的主要信号通路。结论 本研究明确了重楼抗肺癌的关键活性成分、相关调控通路,为滇重楼抗肺癌新药的研制提供理论基...     

内生真菌生物转化提高滇重楼皂苷含量及抗肿瘤作用研究

目的 研究内生真菌Fusarium-C39生物转化提高滇重楼药材皂苷类化学成分的含量,并增强重楼对癌细胞增殖的抑制作用,初步探讨主要甾体皂苷的生物转化机制。方法 将内生真菌Fusarium-C39分别与滇重楼药材固体发酵和与重楼总皂苷提取物液体发酵,比较发酵前后重楼总皂苷和重楼皂苷I、II、VII的含量变化及对肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞和结肠癌HT-29细胞增殖抑制作用的差异;采用UPLC/Q-TOF-MS技术研究发酵前后重楼皂苷类化学成分的变化,并结合甾体皂苷生物合成途径推测内生真菌Fusarium-C39生物转化提高重楼皂苷含量的机制。结果 与滇重楼药材相比较,发酵物中的重楼总皂苷、重楼皂苷I、II和VII的含量显著提高,对3种癌细胞增殖的抑制作用显著增强;人参皂苷Th、pseudoproto-Pb和parisyunnanoside B为Fusarium-C39菌株生物转化提高重楼皂苷I、II和VII含量的主要前体物质,它们在Fusarium-C39菌株的作用下发生了C26糖基水解和环化反应,分别生成了重楼皂苷I、II和VII。结论 内生真菌Fusarium-C39可生物...     

HPLC测定不同采收期滇重楼中薯蓣皂苷元的含量

目的:通过测定不同采收期滇重楼中薯蓣皂苷元的含量,为确定滇重楼的采收期提供参考依据。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-水(90∶10),流速为1.0 mL.min-1,检测波长203 nm,柱温35℃。结果:不同采收期滇重楼中薯蓣皂苷元含量发生明显变化。该成分在4-6月含量逐渐升高,5-6月含量最高,6-7月含量骤降且降幅较大,7-10月含量基本上一致。结论:滇重楼不同采收期薯蓣皂苷元的含量是不同,在实际应用时根据不同需要适时采收。     

HPLC同时测定不同产地滇重楼中的6种重楼皂苷

目的对不同产地滇重楼的质量进行评价研究,摸清目前云南省境内的滇重楼资源情况,为滇重楼资源合理利用和保护提供科学依据。方法收集产自云南省境内13个州(市、地区)的滇重楼样品进行分析,采用HPLC方法测定其6种重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ,PA,H。结果不同产地滇重楼皂苷含量差异较大。结论 重楼皂苷质量受产地、环境因素影响较大,滇重楼品质表现出一定的地域及生境依赖性。     

重楼总皂苷提取工艺研究

目的:优选重楼总皂苷提取工艺。方法:以总皂苷得率为评价指标,采用单因素试验和正交试验优选最佳提取工艺。结果:优化后重楼总皂苷的提取工艺为:70%乙醇提取两次,第一次用10倍量提取2 h,第二次用8倍量提取1.5 h;按优选出的工艺进行提取,总皂苷得率为4.24%,重楼总苷Ⅰ、Ⅱ总提取率为93.28%。结论:验证试验结果表明,优选出的工艺稳定、合理、可行。     

多叶重楼与云南重楼中4种重楼皂苷的积累差异

目的考察多叶重楼Paris polyphylla Smith var.polyphylla与云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的积累差异。方法 HPLC法测定多叶重楼根、叶、茎中4种重楼皂苷含有量,建立20批样品的指纹图谱,聚类分析对2种植物不同部位中各重楼皂苷的积累差异进行评价。结果不同居群多叶重楼中各重楼皂苷含有量及其总量均有显著差异(P0.05,P0.01)。根中未检测到重楼皂苷Ⅵ,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ平均含有量最高;叶中重楼皂苷Ⅶ平均含有量和总含有量最高;茎中仅检测到重楼皂苷Ⅶ,总含有量最低。多叶重楼和云南重楼根的相似度较高,叶和茎较低。根据不同部位重楼皂苷总含有量,样品可分为3类。结论可考虑将多叶重楼作为云南重楼的替代品。     

云南重楼的甾体皂苷类成分

目的：对重楼属（Paris）植物云南重楼（Pads polyphylla Smith vat. yurmanensis）的甾体皂苷类成分进行研究。方法：采用大孔树脂，硅胶柱色谱，Sephadex LH-20及RP-C18等技术分离纯化单体化合物，根据理化性质、波谱数据鉴定其结构。结果：从云南重楼乙醇提取物中分离并鉴定了9个甾体皂苷类化合物：（23S．25s） -3β3,23,27-trihydroxyspirost-5-en-3- O-β- D-glueopyranosyl- （1→6） -β- D-glueopyranoside （ 1 ）、重楼皂苷Ⅰ（2）、重楼皂苷Ⅱ （ 3 ）, （ 25 R ） diosgenin-3- O-β- D-glueopyranoside （ 4 ）, （ 25 R ） diosgenin-3- O-α- L-αrabinofuranosyl （ 1 → 4 ）-β- D- glueopyranoside （5）, （ 25 R ） diosgenin-3- O-α- L-rhamnopyranosyl （ 1 → 2） -β- D-glueopyranoside （6）, （ 25 R ） diosgenin-3- O-β- D-glueopyranosyl （ 1 → 3 ） [ α- L-rhamnopyranosyl （ 1 → 2 ） ]-β- D-glueopyranoside （ 7 ）, （ 25 R ） permogenin-3- O-α- L - arabinofuranosyl （ 1 → 4） [ a-L-rhamnopyranosyl （ 1 → 2）-β-D-glueopyranoside （8）, （ 25R ） permogenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl （ 1→4）-α-L-rhamnopyranosyl （ 1→4）-[ α- L-rhamnopyranosyl（1→2） ]-β-D-glueopyranoside（9） 。结论：化合物1为新化合物。     

滇重楼GAox基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆编码滇重楼赤霉素合成代谢途径中关键酶GA氧化酶(Gibberellic oxidase,GAox)的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。方法:根据滇重楼转录组测序序列,设计特异性PCR引物,利用RT-PCR技术扩增目标基因编码区的全长序列连接至pMD18-T载体上,进行序列测定及序列同源性比较分子系统进化树构建、结构域搜索及蛋白质三维结构预测等生物信息学分析。结果:成功克隆了滇重楼的的6条GAox基因,大小在1000 bp左右,分别命名为PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1和PpGA3ox1。6条基因分别属于GA氧化酶三个不同的亚家族。滇重楼GAox蛋白氨基酸数量均在300~400,理论等电点在4~7左右,带正电荷。PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox4为不稳定蛋白,PpGA2ox3、PpGA20ox1和PpGA3ox1为稳定蛋白,均为没有跨膜结构域和信号肽的亲水蛋白。除了PpGA2ox1亚细胞定位在叶绿体,其他蛋白均定位在细胞质。滇重楼GAox蛋白与不同物种同源序列的序列相似性较高,保守性比较强。结论:首次从滇重楼中克隆了6条GAox基因并对其进行了初步的生物信息学分析。     

不同生境滇重楼根际解磷菌的筛选与鉴定

二级濒危药用植物滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis野生资源严重匮乏,引种栽培可缓解市场需求,筛选滇重楼根际土壤解磷菌,为开发高效微生物菌肥提供数据支撑.该研究从云南、四川和贵州3个地区10个不同地点的野生和移栽品种的滇重楼根际土壤中分离筛选具有矿化有机磷能力的根际解磷菌,经分离纯化后...     

基于HPLC指纹图谱鉴别云南重楼和长柱重楼

目的通过HPLC指纹图谱鉴定云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz和长柱重楼Paris forrestii(Takht.)H.Li.。方法建立20批样品的HPLC指纹图谱,SPSS19.0软件进行聚类分析和主成分分析。结果云南重楼与长柱重楼HPLC指纹图谱的相似度分别为0.905~0.998和0.905~0.986,聚类分析与主成分分析均可将两者明显区分开。结论该方法专属性强、准确度高,可用于重楼属植物的品种鉴定及质量控制。     

滇重楼腐烂程度与4种皂苷含量的关系

目的:测定滇重楼健康、病健交界部分、完全腐烂部分、药材及人工种植滇重楼1级到6级腐烂的样品中4种皂苷的含量。方法:采集云南白药集团武定滇重楼种植基地样品,腐烂等级分类参照植病研究方法,采用HPLC测定其4种重楼皂苷VI、VII、PA和H。结果:不同腐烂程度重楼皂苷含量差异较大。结论:腐烂部分占整个重楼根茎的21%⁴0%的样品重楼皂苷Ⅶ、PA和H含量最高,完全健康和完全腐烂的滇重楼根茎重楼皂苷含量较低。     

陕产宽叶重楼的生药学研究

目的:研究陕产宽叶重楼根茎的生药学特征。方法:采用形态组织学鉴别方法,研究原植物形态、生药性状和显微特征,并使用HPLC法测定4种重楼皂苷的总含量。结果:陕产宽叶重楼原植物来源清楚。根茎显微特征:横切面有栓化表皮,皮层宽广、内皮层不连续,中柱为薄壁组织中散布周木式维管束等结构;生药粉末中含极多单粒淀粉,常见草酸钙针晶、环纹和螺纹导管。HPLC法测定重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量达到3%以上。结论:陕产宽叶重楼来源确定、生药性状稳定,具有特定显微结构,重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量均达到了2015版《中华人民共和国药典》标准。该研究阐释了陕西民间将宽叶重楼根茎与药典所载中药重楼同名等效使用的合理性,为制订宽叶重楼质量标准、寻求中药重楼替代资源奠定了基础。     

菌根真菌对人工栽培滇重楼重金属元素的影响

目的比较接种和不接种丛枝菌根真菌对滇重楼根茎中重金属元素铅、镉、砷、铜、汞的影响。方法通过室温盆栽接种试验方法,采用微波消解-原子吸收光谱法测定并比较收获滇重楼根茎中重金属的差异。结果不同丛枝菌根真菌对滇重楼根茎中重金属量的影响存在差异。接种丛枝菌根真菌能部分地降低其根茎中重金属含有量,所测量值均低于《药用植物及制剂进出口绿色行业标准(WM2-2001)》和《中国药典》2010年版相应的重金属限量标准。结论人工接种丛枝菌根真菌可保证滇重楼临床用药的安全性。