Aβ3-10重复片段质粒免疫接种AD鼠后对脑内BACE1的影响

目的探讨Aβ3-10重复片段质粒免疫接种3月龄APPswe/PSEN1双转基因(AD)鼠脑内BACE1的影响。方法应用Aβ3-10重复片段质粒免疫3月龄APPswe/PSEN1双转基因鼠,同等剂量的PBS免疫对照组及C57BL/6J组小鼠,各组小鼠均在免疫后2、4、6次后通过RT-PCR法检测BACE1 m RNA水平,Western blotting法检测BACE1/GFAP/NF-κB蛋白水平,免疫组化法观察Aβ1-42脑内分布情况。水迷宫检测其行为学改变。结果在免疫2次后BACE1 m RNA表达水平C57BL/6J组Aβ3-10组对照组(F=4.649,P=0.021);免疫4次Aβ3-10组C57BL/6J组对照组(F=115.683,P=0.001);免疫6次C57BL/6J组Aβ3-10组对照组(F=86.600,P0.001)。BACE1的蛋白表达水平在免疫2、4、6次后C57BL/6J组Aβ3-10组对照组(F=432.843,P0.001;F=57.673,P0.001;F=26.550,P=0.001),NF-κB的蛋白表达水平在免疫2次后C57BL/6J组Aβ3-10组对照组(F=109.127,P0.001);免疫4,6次后Aβ3-10组C57BL/6J组对照组(F=30.301,P0.001;F=129.967,P0.001)。GFAP的蛋白表达水平在免疫2、4、6次后C57BL/6J组Aβ3-10组对照组(F=27.782,P=0.001;F=26.132,P=0.001;F=26.450,P=0.001);Aβ1-42在脑内的分布C57BL/6J组Aβ3-10组对照组(皮质:F=5.395,P=0.021;F=47.135,P=0.000;F=25.306,P=0.000,海马:F=11.023,P=0.002;F=14.936,P=0.001;F=50.132,P=0.000)。总潜伏期C57BL/6J组Aβ3-10组对照组(F=8.938,P=0.016;F=5.745,P=0.04;F=7.073,P=0.017)。结论 Aβ3-10重复片段质粒可以影响脑内BACE1的表达,影响Aβ产生,改善空间记忆能力。     

加兰他敏抗β淀粉样蛋白的神经保护机制研究

目的观察加兰他敏(Gal)对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后β淀粉样前体蛋白(APP)代谢通路的影响,探讨Gal的神经保护机制。方法采用5μMAβ_(1-40)作用于SH-SY5Y细胞制备体外细胞损伤模型,0.3μM加兰他敏对Aβ_(1-40)处理的细胞进行干预并与正常细胞进行对照研究。倒置显微镜下观察细胞形态,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活力,Western-blot技术定量检测各组APP,sAPPα,β-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(BACE1)表达水平。结果 Aβ_(1-40)孵育细胞24h之后,细胞损伤明显,存活率从95.78.±2.5%降到62.93±2.1%,与对照组相比差异显著(P0.01);Western-blot显示细胞内BACE1表达增加,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα降低;在Aβ_(1-40)孵育之前给予加兰他敏作用24h,细胞损伤程度减轻,细胞的存活率上升(85.26±5.3%)(P0.01),细胞内BACE1表达较Aβ组下降,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα升高。结论加兰他敏通过抑制Aβ_(1-40)诱导的APP的异常代谢发挥神经保护作用。     

脑老化糖基化终末产物上调BACE1活性促进Aβ生成

目的 探讨糖基化终末产物(AGEs)在β-淀粉样蛋白(Aβ)产生中分子机制.方法 以APPsw-N2a细胞为AD细胞模型,将细胞随机分为3组,空白对照组、AGEs组、AGEs+抗RAG抗体组.采用ELISA方法检测各组Aβ40和Aβ42的表达水平,并用荧光检测法检测BACE1的活性.结果 与对照组相比,AGEs组Aβ40、Aβ42表达水平及BACE1活性明显增加,差异有统计学意义(P＜0.01);预先用抗RAG中和抗体(1∶100)1 h后,Aβ40,Aβ42表达水平及BACE1活性与AGEs组相比较明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 AGEs可能通过上调BACE1的活性促使APPsw-N2a细胞Aβ生成增加,提示AGEs可能在AD发生、发展中起重要作用.     

缺氧及复氧对淀粉样前体蛋白、去整合蛋白和金属蛋白水解酶10和淀粉样β分泌酶蛋白表达的影响

目的研究缺氧及复氧损伤对淀粉样前体蛋白(APP)、去整合蛋白和金属蛋白水解酶10(ADAM 10)和淀粉样β分泌酶(BACE 1)蛋白表达的影响。方法分为缺氧组和对照组。缺氧组在缺氧条件下(95%N2,5%CO2)培养SH-SY 5Y细胞24h后复氧,分别于0h、12h、24h利用W estern-b lot方法检测APP、ADAM 10和BACE 1蛋白表达;对照组在正常情况下培养,与缺氧组同一时间进行接种和处理。结果缺氧培养SH-SY 5Y细胞24h后复氧各时间点APP蛋白表达与对照组相比差别无统计学意义(P=0.818,0.728和0.674);ADAM 10蛋白表达分别较对照组下降25.5%,67.3%和75.9%(P=0.001,0.001,0.000);BACE 1蛋白表达分别较对照组增加22%,42%和51.5%(P=0.021,0.000和P=0.000)。结论缺氧及复氧可以降低ADAM 10蛋白表达和增加BACE 1蛋白表达。提示血管因素可能使APP更易通过产生淀粉样肽(Aβ)途径裂解,而参与SAD的病理过程。     

降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽生成的影响

目的观察降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)生成的影响,初步探讨胆固醇和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的相关性。方法以稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为模型,分别给予β-甲基环糊精或洛伐他汀对细胞系进行处理;胆固醇定量试剂盒测定细胞内胆固醇水平的变化,放射免疫法测定细胞培养液中Aβ的含量,Western Blot方法半定量检测全长型APP和可溶性APPα的水平。结果β-甲基环糊精和洛伐他汀处理组分别降低细胞胆固醇水平67.5%和49.5%(P<0.05),细胞培养液中Aβ含量分别降低39.5%和25.7%(P<0.05),sAPPα含量分别增加3.5倍和2.0倍(P<0.05)。结论降低细胞胆固醇水平使细胞外Aβ含量减少,sAPPα含量增加,这提示胆固醇可能通过影响APP代谢途径而参与AD的病理过程。     

丁基苯酞通过调节自噬干预淀粉样蛋白前体β位剪切酶1的代谢

目的在氧糖剥夺(OGD)细胞模型中,初步探讨丁基苯酞(NBP)调节β淀粉样蛋白(Aβ)代谢中关键酶淀粉样蛋白前体β位剪切酶1(BACE1)水平的可能机制。方法采用Neuro-2a/APP695细胞,建立脑缺血体外OGD细胞模型,观察NBP对自噬抑制剂(3-MA)和自噬诱导剂雷帕霉素(Rapa)的作用。以NBP 10μmol·L-1为后续实验干预浓度分组:1对照组,不做处理;2 OGD组,OGD 1 h;3 OGD+NBP组;4 OGD+NBP+Rapa组,200 ng·L-1 Rapa预处理1 h;5 OGD+NBP+3-MA组,5 mmol·L-1 3-MA预处理1 h。采用单丹染色、Western blot及电镜等方法检测BACE1、LC3蛋白、抗凋亡蛋白(Bcl-2)和Beclin1蛋白水平以观察NBP调节自噬。结果 OGD处理后,细胞中BACE1蛋白表达降低(P0.05)。3-MA可增加BACE1蛋白表达(P0.01)。上调自噬及NBP可降低BACE1蛋白表达(P0.05)。此外,NBP增加Bcl-2表达而减弱应激损伤(P0.05)。结论 NBP可下调BACE1表达,其可能通过抑制自噬过度激活和(或)抗凋亡作用而保护细胞应对应激损伤。     

β-淀粉样肽对人SH-SY5Y细胞突触素、发动蛋白Ⅰ及衔接蛋白180表达的影响

目的 探讨β-淀粉样肽(Aβ)对人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞突触素(Syn)、发动蛋白Ⅰ (Dyn Ⅰ)及衔接蛋白180(AP180)表达的影响。 方法 分别应用0.01、0.1、1、2及5μmol/LAβ1-42处理SH-SY5Y细胞,对照组细胞不加任何处理。MTT法检测细胞增殖情况,Western blotting 检测0.5、1μmol/L Aβ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynⅠ和AP180蛋白表达,RT-PCR检测1 μmol/L Aβ1-42处理组及对照组细胞Syn、DynⅠ和AP180 mRNA表达。 结果 0.1 μmol/L Aβ1-42处理细胞即可出现细胞增殖率下降,并呈剂量依赖性负性相关关系,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05); 0.5 μmol/L Aβ1-42处理细胞可见DynⅠ蛋白表达降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);1 μmol/L Aβ1-42处理细胞可见Syn、DynⅠ蛋白及mRNA表达均降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);但未见AP180蛋白及mRNA表达水平发生改变。 结论 Aβ1-42可引起人SH-SY5Y细胞Syn和DynⅠ表达降低,该改变可能与AD发病中学习记忆能力减退有关。     

不同浓度β-淀粉样蛋白寡聚体的毒性差异

目的探讨不同浓度的β淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)寡聚体毒性的差异。方法 0.5μmol/L,1μmol/L,1.5μmol/L,2μmol/L,2.5μmol/L,3μmol/L的Aβ1-42寡聚体(A-βderived diffusible ligands,ADDLs)处理PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞),western blot检测钙蛋白酶(calpain)的激活程度,蛋白激酶A的催化亚基(catalytic subunits of cAMP-dependent kinase,PKA-C)和磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(phosphory lated cAMP response element binding protein,pCREB)的表达水平。结果所有浓度的ADDLs均导致pCREB的下降(P0.05),但均未影响PKA-C的含量(P0.05)。0.5μmol/L,1μmol/L,1.5μmol/L的ADDLs导致pCREB的下降与calpain的激活无关,而2μmol/L,2.5μmol/L,3μmol/L的ADDLs导致pCREB的下降与calpain激活有关。结论不同浓度ADDLs通过不同毒性通路导致pCREB下降:高浓度的ADDLs通过激活calpain,而低浓度ADDLs则可能通过其他途径,但两者均未通过影响PKA-C的含量来降低pCREB水平。     

二十烷酸对大鼠原代皮质神经元APP及BACE1表达的影响

目的 观察二十烷酸对大鼠原代皮质神经元β-淀粉样前体蛋白(APP)及β-分泌酶(BACE1)表达的影响,探讨饱和脂肪酸在阿尔茨海默病发病机制中的作用. 方法 将原代培养的大鼠皮质神经元分为2组:对照组、二十烷酸组.Western blotting法检测神经元APP、BACE1蛋白表达,RT-PCR法分析APP及BACE1 mRNA表达. 结果 与对照组相比,二十烷酸组神经元APP751+770mRNA表达和APP蛋白表达显著升高,BACE1蛋白表达也显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 饱和脂肪酸增加APP及BACE1表达,可能在阿尔茨海默病发病机制中起重要作用.     

糖原合成酶激酶3β活性增加参与β淀粉样蛋白31~35诱导的HT22海马神经细胞Bmal1表达降低

目的探讨糖原合成酶激酶3β(GSK3β)在β淀粉样蛋白31~35(Aβ31~35)引起小鼠海马HT22神经细胞Bmal1基因/蛋白表达降低中的作用。方法采用小鼠海马神经细胞HT22作为实验对象,将HT22细胞按随机数字表法分为对照组、Aβ31~35处理组、LiCl+Aβ31~35处理组。以1%血清饥饿1 h来诱导细胞同步化(昼夜时间0,即CT0)。采用细胞增殖-毒性检测法检测细胞存活率;采用实时荧光定量PCR法检测上述各组细胞CT4、CT8、CT12、CT16、CT20、CT24时间点Bmal1基因的表达水平;采用Western印迹方法检测各组GSK3β表达情况及BMAL1蛋白表达水平。结果Aβ31~35诱导HT22细胞Bmal1 mRNA及BMAL1蛋白水平在CT20时间点较对照组显著降低(Bmal1 mRNA:分别为0.38±0.06与0.83±0.08,t=4.549,P=0.001;BMAL1蛋白:分别为0.67±0.04与1.00±0.04,t=5.943,P<0.001)。与对照组相比,Aβ31~35引起HT22细胞GSK3β活性增加,表现为GSK3βSer9位点(GSK3βS9)磷酸化水平较对照组显著降低,磷酸化GSK3βS9与GSK3β比值下降(分别为0.66±0.08与1.02±0.14,t=2.217,P=0.025);Aβ31~35引起HT22细胞存活率显著降低(分别为71.85%±6.20%与98.14%±2.68%,t=3.891,P=0.006),GSK3β抑制剂LiCl预处理后有效逆转Aβ31~35诱导的HT22细胞存活率下降(LiCl+Aβ31~35处理组与Aβ31~35处理组分别为90.74%±5.74%与71.85%±6.20%,t=3.412,P=0.010);LiCl预处理可以明显逆转Aβ31~35所致CT20时间点Bmal1 mRNA及BMAL1蛋白水平降低(LiCl+Aβ31~35处理组与Aβ31~35处理组Bmal1 mRNA分别为:0.72±0.05与0.38±0.06,t=4.378,P=0.001;BMAL1蛋白分别为:0.90±0.04与0.67±0.04,t=4.052,P=0.002)。结论GSK3β活性增加参与Aβ31~35引起的HT22细胞Bmal1基因/蛋白表达降低。     

阿托伐他汀对淀粉样β蛋白诱导大鼠原代海马神经元损伤保护作用的研究

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ato)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的体外培养原代海马神经元损伤保护作用。方法选用出生0~24hSprague-Dawley大鼠乳鼠,解剖显微镜下分离海马,进行海马神经元体外培养,培养10d后用于实验。将培养的海马神经元分为3组:(1)正常对照组:加入含有1%(质量浓度)DMSO培养基;(2)Aβ1-42组:加入1.25μmol/L Aβ;(3)Aβ(1.25μmol/L)+不同浓度阿托伐他汀组(0.1、0.5、1、2.5μmol/L)。应用CellTiter-GloTM荧光细胞活性试剂盒检测培养海马神经元ATP含量,用以反映神经元活力;通过CytoTox-ONETM试剂盒测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用以测定神经元细胞膜的损伤程度;应用免疫荧光染色观察神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD-95)、bassoon蛋白表达。Western印迹法半定量检测海马神经元突触蛋白SYP、PSD-95、bassoon的改变。结果与正常对照组比较,培养10d海马神经元经1.25μmol/L Aβ1-42作用48h后,其ATP和LDH水平均明显降低(均P0.01),而0.5、1.0、2.5μmol/L Ato组能够明显抑制Aβ1-42引起的ATP和LDH水平降低(P0.01)。免疫荧光及Western blot结果显示,1.25μmol/L Aβ1-42可使海马神经元SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达明显降低,而Ato能够明显抑制Aβ1-42引起的SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达降低。结论 Ato对Aβ诱导的体外培养海马神经元毒性有保护作用,这种保护作用可能与Ato对抗Aβ1-42引起的海马神经元SYP、PSD-95、bassoon表达降低有关。     

胰岛素抵抗大鼠认知功能的变化及其脑组织Alzheimer样病变

目的研究胰岛素抵抗大鼠(IR)认知功能的变化及其脑组织胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性、β-淀粉样(Aβ42)、P-Tau(ser396)、淀粉样前体蛋白(APP),β-分泌酶(BACE1)及早老素(PS1)的表达,探讨胰岛素抵抗在阿尔茨海默病(AD)中可能的作用机制。方法从25只Wistar雄性大鼠中随机选取10只作为正常对照组(NC),以普通标准饲料+自来水喂养;余15只为模型组以普通标准饲料+10%果糖水连续喂养12周后筛选出IR大鼠13只;12周末用Morris水迷宫试验测定各组大鼠认知功能行为学改变,放免法检测血浆胰岛素水平,葡萄糖氧化酶法检测血浆葡萄糖水平,化学比色法测定ChAT的活性,免疫组化法检测APP、Aβ42,蛋白印迹法检测BACE1,PS1及P-Tau(ser396)蛋白表达水平。结果 IR组大鼠逃避潜伏期较NC组明显延长(P0.01);IR组血浆血糖、胰岛素水平及运用HOMA-IR计算的胰岛素抵抗指数均显著高于NC组(P0.01);IR组ChAT的活性较NC组明显降低(P0.01);与NC组相比,IR组APP、Aβ42平均光密度值明显升高,组间差异有统计学意义(P0.01);IR组大鼠脑组织中BACE1,PS1及P-tau(ser396)蛋白表达水平较NC组显著增高(P0.01)。结论胰岛素抵抗大鼠认知功能受损,其程度与ChAT的活性相关;胰岛素抵抗通过上调BACE1,PS1的活性,使Aβ生成增加,同时P-Tau蛋白表达增加,从而可能参与类AD病变的发生。     

胰岛素信号通路磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶对海马神经元β-淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的 通过胰岛素和磷脂酰肌醇-3激酶(PDK)抑制剂渥曼青霉素(wortmannin,WORT)对PI3K/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PDK/Akt)信号通路的激活和抑制作用,观察PI3K/Akt信号通路对海马神经元B-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响.方法 40只SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、胰岛素组和WORT组(每组10只),海马立体定向注射胰岛素和PI3K抑制剂WORT.免疫组织化学和Western blot法检测PI3K/Akt信号传导相关蛋白以及BACE1的表达水平.结果 注射胰岛素的海马PI3K信号通路下游信号分子较对照组:Akt表达增加(0.952±0.060与0.835±0.029,t=4.9150,P=0.0001),Akt set473位点磷酸化(pAkt)水平上调(0.800±0.075与0.657±0.025,t=4.5598,P=0.0002),糖原合成激酶-3α(GSK-3α)磷酸化水平降低(0.604±0.062与0.726±0. 041,t=3.5871,P=0.0018),而成熟的BACE1及其裂解产物β分泌酶C末端(β-CTF)表达下调.WORT组的PI3K下游信号分子Akt、pAkt表达明显被抑制,磷酸化GSK-3α表达增加,同时成熟的BACE1(1.004±0.096)和β-CTF(1.031±0.048)的表达较对照组(分别0.498±0.064,0.786±0.101)上调(分别t=11.5980,P=0.0000;t=4.2194,P=0.0004).结论 胰岛素信号通路PI3K/AKt可以调节BACE1的表达和活性并参与阿尔茨海默病的发病机制.     

亚低温对颅脑创伤大鼠脑组织中β-分泌酶表达的影响

目的 研究亚低温对大鼠颅脑创伤(TBI)后β-分泌酶(BACE)的影响.方法 应用液压冲击装置制作大鼠颅脑创伤模型,实验分为假手术组、创伤常温组(37℃)和创伤亚低温组(32℃),每组12只大鼠.采用免疫组织化学和免疫荧光法检测BACE表达部位,采用RT - PCR和免疫印迹法研究BACE mRNA和蛋白表达水平.结果 与假手术组比较,创伤常温组大鼠脑组织BACE免疫阳性细胞数明显增多,BACE mRNA和蛋白表达上升(P＜0.05).但是,可以看出BACE在给予亚低温处理后的免疫阳性细胞数量以及蛋白水平显著低于常温处理组(P＜0.05),与假手术组比较差异无统计学意义.结论 亚低温可以通过降低颅脑创伤后BACE表达水平来减轻继发性脑损伤程度,起到神经保护作用.     

一种稳定阿尔茨海默病细胞模型的建立方法

目的旨在应用不同浓度Aβ_(1-42)诱导新生SD大鼠海马神经元,建立稳定阿尔茨海默病细胞模型。方法分离并培养新生24 h内SD大鼠原代海马神经细胞;分别加入不同浓度Aβ_(1-42)诱导,诱导后采用MTT法观察细胞活力,选取理想Aβ_(1-42)诱导的海马神经细胞作为阿尔茨海默病细胞模型;通过免疫荧光技术(IF)鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)在海马神经元细胞的表达。结果 Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降,可导致海马神经元细胞胞体变形、收缩和细胞膜完整性破坏,胞间网络结构消失或断裂,细胞外基质乱不清,神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降与Aβ_(1-42)浓度成线性关系;加入不同浓度Aβ_(1-42)(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L)后实验各组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%,(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%,其中20μmol/L组与0μmol/L组相比P<0.05,30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L组与对照组相比P<0.01。结论 Aβ_(1-42)可导致海马神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)浓度为20μmol/L诱导的SD大鼠海马神经元可作为理想的阿尔茨海默病细胞模型。     

SMAD6在Aβ诱导的神经毒性病变中的表达变化

目的探讨母抗Dpp小同源物6(small mothers against decapentaplegic homolog 6,SMAD6)在β淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)诱导的神经毒性病变中的表达变化。方法取孕15~17d的SD大鼠的胎鼠,进行海马神经元原代培养,经不同浓度(10、15、20μmol/L)Aβ25-35毒性片段处理后,通过定量PCR技术检测SMAD6mRNA表达水平。取2月龄SD雄性大鼠12只,随机分为Aβ注射组和空白对照组,每组6只。采用双侧基底前脑注射Aβ1-40建立大鼠痴呆模型,通过免疫组化及免疫印迹检测基底前脑及海马区SMAD6蛋白表达水平。结果不同浓度Aβ25-35处理组海马神经元内SMAD6mRNA表达均较对照组减少(F=602.1,P0.01)。免疫组化结果显示,与对照组比较,Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区SMAD6蛋白表达减少(68103±1520比96036±1804;t=20.51,P0.01),而海马区其表达增多(96441±1852比55039±1528;t=29.87,P0.01);免疫印迹结果显示,与对照组比较,Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区SMAD6蛋白表达减少(0.1042±0.0067比1.000±0.0986;t=15.69,P0.01),而海马区其表达增多(12.5525±2.6803比1.000±0.0135;t=7.465,P0.01)。结论 Aβ可直接下调神经元内SMAD6mRNA转录及表达,不同脑区内SMAD6蛋白表达可能受负反馈调节机制影响。     

下调孕烷X受体表达对谷氨酸诱导的小鼠脑微血管内皮细胞P-糖蛋白表达和功能的影响

目的探索下调孕烷X受体(PXR)表达对谷氨酸(GLU)模拟癫痫发作环境下小鼠脑微血管内皮细胞(m BMEC) P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的影响。方法体外培养小鼠脑微血管内皮b End. 3细胞,分为不同浓度GLU处理组(以0μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L GLU处理细胞30 min),GLU不同时间处理组(以100μmol/L GLU处理细胞0 min、15 min、30 min);使用siRNA-PXR特异性抑制PXR表达,分为对照siRNA(NC siRNA)+GLU组、siRNA-PXR+GLU组。Western blotting检测细胞PXR和P-gp蛋白表达,细胞免疫荧光法检测细胞核内PXR蛋白表达,RT-qPCR检测细胞P-gp mRNA表达,罗丹明123(Rh123)细胞蓄积实验检测P-gp外排功能。结果与空白组相比,50μmol/L和100μmol/L GLU组PXR和P-gp蛋白表达均增高(均P 0. 05),尤以100μmol/L组PXR和P-gp蛋白表达最明显。与空白组相比,15 min和30 min组PXR蛋白表达均增加(均P 0. 05),30 min组P-gp蛋白表达增加(P 0. 05)。与空白组相比,100μmol/L GLU组胞核内PXR表达增加(P 0. 05)。与NC siRNA+GLU组相比,siRNA-PXR+GLU组PXR蛋白表达下调了37%[(1. 00±0. 00) vs (0. 63±0. 18); t=3. 41,P=0. 02],P-gp蛋白表达下调了43%[(1. 00±0. 00) vs(0. 57±0. 09); t=7. 94,P=0. 00],P-gp mRNA表达下调了52%[(1. 00±0. 04) vs (0. 48±0. 08); t=10. 98,P=0. 00]。GLU组细胞内Rh123荧光强度(0. 72±0. 01)较空白组降低[(1. 00±0. 03); t=9. 66,P=0. 00];GLU+维拉帕米(P-gp抑制剂)组(1. 07±0. 04)较GLU组增高(t=-11. 93,P=0. 00); siRNA-PXR+GLU组(0. 91±0. 03)较NC siRNA+GLU组增高[(0. 69±0. 05); t=-7. 52,P=0. 00]。结论下调PXR表达能够抑制m BMEC在GLU模拟癫痫发作环境下的P-gp表达及其功能,提示PXR参与调控癫痫发作诱导血-脑屏障P-gp表达及其功能。     

β-淀粉样蛋白对星形胶质细胞分泌组织蛋白酶B作用的研究

目的研究β-淀粉样蛋白(Aβ)对星形胶质细胞活性、形态学以及分泌组织蛋白酶B(CB)的影响。方法体外培养星形胶质细胞,采用免疫细胞化学方法对星形胶质细胞进行鉴定;观察加入不同浓度溶解状态的Aβ1-40后细胞形态学改变,采用四唑盐法检测细胞活性,Western blot法测定细胞上清CB表达水平。结果将不同浓度新鲜Aβ1-40加于星形胶质细胞分别培养24 h,各浓度Aβ1-40对星形胶质细胞活性均无明显影响(P0.05);随时间延长,经40～60μmol/LAβ1-40处理的星形胶质细胞逐渐出现肿胀、坏死;经15、20、25μmol/L Aβ1-40诱导的星形胶质细胞上清中检测到CB表达,随Aβ1-40浓度增高可见蛋白质显影增强且带形清晰。结论 Aβ1-40可激活星形胶质细胞并诱导其释放CB,提示Aβ激活的星形胶质细胞及其释放的CB可能在AD发病中起着一定作用。     

五味子乙素对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨五味子乙素对Aβ25-35引起的褐家鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞毒性的作用,并探讨其可能机制。方法 10、25、50、75、100μmol/L五味子乙素作用于PC12细胞,MTT法筛选低毒性的五味子乙素浓度,Aβ25-35诱导PC12细胞毒性损伤建立阿尔茨海默病体外模型,加入低毒性的五味子乙素,倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测细胞活性,RT-PCR法检测PC12细胞β淀粉样前体蛋白(amyloidβ-protein precursor,APP)基因mRNA的表达水平。结果 10、25μmol/L五味子乙素单纯处理可促进PC12细胞增殖,以10μmol/L增长作用更明显,差异具有统计学意义(P0.05),50、75、100μmol/L五味子乙素对细胞有抑制作用,抑制率10%;给予Aβ25-35诱导后PC12细胞存活率降低为(46.4±4.9)%,APP基因表达上调(105±9.3)%;给予10μmol/L的五味子乙素处理后的Aβ25-35组,细胞存活率升高至(107±5.5)%,APP基因表达减少(66.9±7.2)%。结论 10、25μmol/L五味子乙素均可以促进PC12细胞增长,但不具有浓度依赖性;10μmol/L五味子乙素可拮抗Aβ25-35对PC12细胞的损伤作用,机制可能是通过减少APP表达而起作用。     

稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白细胞模型的建立与鉴定

目的 建立和鉴定稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(APP)的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型.方法 脂质体转染法将含人野生型APP751 cDNA的真核表达质粒pcDNA3/APP APP751WT转染至SH-SY5Y细胞,G418对转染后细胞进行筛选,获得稳定表达人野生型APP751细胞模型.Western blotting法、MTT比色法和放射免疫法检测细胞APP表达水平、细胞生长情况和细胞内外β-淀粉样蛋白(Aβ)表达水平.结果 转染组细胞APP表达水平明显高于未转染组和空载体组.未转染组和空载体组细胞滞留期为12 h,对数生长期为12 h-4 d;转染组细胞滞留期为24h,对数生长期为1～4d;培养12 h后,转染组细胞活力低于未转染组和空载体组(t=4.363,P=0.0012;t=4.040,P=0.003),培养1 d后,转染组细胞活力降低,且低于未转染组和空载体组(t=4.736,P=0.001;t=4.317,P=0.005),其余各时间点差异均无统计学意义(P>0.05).转染组细胞细胞外Ap表达水平高于未转染组和空载体组(t=7.690,P=0.000;t=7.448,P=0.000),而3组细胞细胞内A8表达水平则差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功建立稳定表达人野生型APP751的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制提供了良好的细胞模型.