丙型肝炎病毒非结构基因5b变异与干扰素治疗的相？…

目的 研究ＨＣＶ基因组的变异与干扰素治疗应作的关系以及干扰素治疗后患者体内病毒株的发迹和变异。方法 ８例慢性丙型肝炎患者给予干扰素治疗，于治疗前及治疗后采集口才血清，扩增其血清中ＨＣＶ非结构基因５ｂ（ＮＳ５ｂ）区ｃＤＮＡ，克隆后，每例患者换取６个克隆，测定重组子中ＮＳ５ｂｃＤＮＡ序列。结果 ４例患者在治疗后血清中ＨＣＶ阴性，为干扰素反应组，另４例于治疗中、治疗后血清中ＨＣＶ ＲＮＡ持续阳性，为非的     

慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒NS5A区序列与干扰素疗效的关系

目的　探讨上海地区丙型肝炎病毒 (HCV) 1b亚型慢性感染者的血清HCV非结构基因5A(NS5A)与干扰素 (IFN)疗效的关系。方法　收集上海地区 2 4例HCV1b慢性感染者在干扰素治疗前后及随访过程中的血清标本 ,定量检测治疗前血清HCVRNA ,用逆转录 聚合酶链反应方法扩增NS5A的干扰素敏感决定区 (ISDR)基因并进行测序和分析。另扩增干扰素应答类型不同的 3例患者治疗前后共 5株HCV病毒的NS5A全长序列 ,测序后作种系发生树分析及蛋白二级结构预测。结果　治疗前血清HCVRNA的定量结果显示 ,持续应答组的病毒滴度 (平均滴度 4 50× 1 0 4copies ml)明显低于复发组和无应答组 (平均滴度 1 82× 1 0 7copies ml)。 2 4例慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前血清HCV的ISDR氨基酸序列与抗干扰素的HCV J株比较 ,1 3例为野生型 ,1 1例为中间型 ,无突变型。 6例完全应答者 3例感染的是野生型株 ,另 3例感染的是中间型病毒株。 5株HCV病毒的NS5A全长序列种系发生树显示 ,3种不同应答类型株在种系发生上分属 3个组别 ,无应答株与抗干扰素的HCV J株关系相近被归为 1组。蛋白质二级结构预测显示 ,上述病毒株NS5A蛋白在二级结构方面基本相似 ,仅在 2 2 55～ 2 2 89范围内有明显不同 ,这一区域与PKR结合域部分重叠。结论　HCVNS5A基因     

丙型肝炎病毒非结构基因5b(NS 5b)区一级结构的变异

目的　分析中国丙型肝炎病毒非结构基因５ ｂ 区核苷酸序列变异。方法　以逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ） 从４９ 例中国病人的血清中获得互补的ＤＮＡ片段,产物克隆后测序。结果　３３ 株系基因Ⅱ１ ｂ 型,１６ 株系Ⅲ２ ａ 型,中国ＨＣＶ株型与日本ＨＣＶ株型同属１ 个基因亚型,但在一些核苷酸保守位点上有一定的差异,对３３ 株Ⅱ１ ｂ 型和１６ 株Ⅲ２ ａ 型间的同源性进行比较,发现１６ 株Ⅲ２ ａ 型的同源性低于３３ 株Ⅱ１ ｂ 型的同源性。首次在ＨＣＶＮＳ５ ｂ 区发现１ 个新的３ 个核苷酸的缺失突变及１ 个移码突变。结论　同一基因亚型之内不同ＨＣＶ株的核苷酸序列可能具有一定的地理分布特征,每个地区有一定的流行株。     

基因1b型丙型肝炎病毒NS5A区变异及其与聚乙二醇干扰素α-2a联合利巴韦林治疗应答的相关性

目的探讨基因1b型慢性丙型肝炎患者NS5A区基因变异与聚乙二醇干扰素α-2a（PEG—IFNα-2a）联合利巴韦林（RBV）抗病毒治疗疗效的关系。方法回顾性选择15例应用PEG—IFNα-2a／RBV抗病毒治疗的基因1b型慢性丙型肝炎患者,其中7例为快速应答（RVR）,8例为无应答（NR）,应用RT—PCR法扩增NS5A全长片段,用克隆测序方法进行核苷酸和氨基酸序列测定。结果没有发现与治疗应答相关的单个氨基酸或基序变异,RVR组和NR组在NS5A、ISDR、PKRBD和IRRDR区的氨基酸突变数目差别均无统计学意义,RVR组在V3区（aa2356～2379）的氨基酸突变数目高于NR组（分别为5．3±0.5和3．4±0．6,P=0．03）。结论V3区的氨基酸突变数目与PEG—IFNα-2a联合RBV抗病毒疗效可能相关。     

肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因（NS）5区cDN …

通过逆转录－套式－聚合酶链反应，从２例肝癌患者血清中扩增出长９９４ｂｐ的庚型肝炎病毒（ＨＧＦ）ｃＤＮＡ序列，聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物纯化后以双脱氧末端终止法从双向直接测定其序列。结果，所分离的２株ＨＧＶ ＮＳ５区９９４ｂｐ核苷酸与国外已发表的３株ＨＧＶ序列比较，同源性为８７．２１％￣９３．６７％；２株间的同源性为９３．９２％。根据所测得的ｃＤＮＡ序列推导出其编码的３１３氨基酸序列，在氨基酸水平上     

湖北地区119例 HCV 1b 型 NS3丝氨酸蛋白酶区的序列变异研究

目的：分析丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)1b 型非结构蛋白3(non-structure protein 3, NS3)丝氨酸蛋白酶区序列的变异规律及影响意义。方法使用基因型别特异性引物,通过巢式 PCR 的方法扩增119例慢性 HCV 1b 型患者血清中 HCV NS3区。对 PCR 产物进行测序后获得 NS3区核苷酸及氨基酸序列。分析119例 HCV 1b 型 NS3区序列的同源性及种系进化,分析 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异情况及重要功能位点的突变情况。结果湖北地区 HCV 1b 型与 HCV 1b 型标准株及亚洲地区序列同源性较高,核苷酸序列同源性为85.94％及87.68％,氨基酸序列同源性可达96.83％及92.39％,而与欧美地区1b 型同源性较低,核苷酸序列同源性均为85.57％,氨基酸序列同源性分别为92.17％及93.38％。进化树分析提示湖北地区序列与中国其他地区序列亲缘性较接近,而与日本、东南亚地区及欧美地区的1b 型亲缘性较远。 NS3丝氨酸蛋白酶区185个氨基酸内有34个位点有氨基酸突变,但其重要的功能区包括催化酶底物特异性结合位点以及 Zn2﹢结合位点在所有序列中均高度保守,无一例发生突变。结论对湖北地区 HCV 1b型 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异规律及生物学意义的研究进一步丰富和完善了对 HCV 1b 型基因组变异情况的认识。为了解 HCV1b 型在中国地区的进化过程提供一定理论基础。     

丙型肝炎病毒非结构基因5b的变异及与干扰素治疗的关系

以聚合酶链反应直接序列分析方法测定了４例无症状慢性丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者，与９例接受干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者血清中ＨＣＶ非结构基因５ｂ（ＮＳ５ｂ）ｃＤＮＡ的序列。发现，与已发表的Ⅱ／１ｂ型ＨＣＶ序列相比，无症状慢性ＨＣＶ感染者的ＨＣＶ在核苷酸水平的同源性高于干扰素治疗有效的慢性丙型肝炎患者（９５．６５％±２．６１％比９４．３５％±２．２９％），后者又高于干扰素治疗无效的慢性丙型肝炎患者（９２．７０％±１．９０％）。还发现在干扰素治疗后，治疗无效者血清中ＨＣＶＮＳ５ｂｃＤＮＡ序列发生明显变化，在所测定的３８０个核苷酸中有９～４８个发生碱基替换，从而导致所编码的氨基酸中有６～２０个发生突变。结果提示，ＨＣＶＮＳ５ｂ基因变异与病情及干扰素治疗有一定关系。变异较大者常出现明显的临床表现，且干扰素治疗可能趋势于失败。     

中国庚型肝炎病毒河南株非结构基因（NS）3区cDNA的克隆 …

目的 为了研究中国庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构（ＮＳ３）区基因结构特征。方法 利用逆转录－半巢式－聚合酶链反应从河南１份ＨＧＶ ＲＮＡ阳性血清获得覆盖ＨＢＶ ＮＳ３全长ｃＤＮＡ的４个片段，并克隆到ｐｃＤＮＡⅡ载体中，采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列。结果 发现克隆到的包括ＨＢＶ ＮＳ３区在内的ｃＤＮＡ序列和度为２１３７个核苷酸，编码７１１个氨基酸。与国内外已测定的５株全序列的相     

慢性丙型肝炎肝组织HCV特异性CTL活性对干扰素应答效果的影响

目的 了解肝组织丙型肝炎病毒（HCV）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性对慢性丙型肝炎患者干扰素治疗效果的影响。方法 用标准铬释放法对45例拟接受α干扰素治疗的慢性丙型肝炎（慢丙肝）患者肝组织CD8^ HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞（HCV－CTL）活性进行检测,观察CTL活性与干扰素疗效的关系。结果 45例慢丙肝中20例（44．4％）肝组织HCV－CTL活性阳性。在完成干扰素治疗的42例中,19例HCV－CTL活性阳性。经过6个月的干扰素治疗,42例中共18例（42．9％）获得治疗终点完全应答15例（78．9％）为ETR,而23例HCV－CTL活性阴性患者仅3例（13．05）为ETR（P＜0．01）;10例持续应答者均为HCV－CTL活性阳性患者。结论 机体细胞免疫,尤其是CD8^ HCV-CTL介导的细胞免疫在决定慢性丙型肝炎干扰素治疗的效果中起重要作用。     

丙型肝炎病毒准种多样性与病毒血症水平、疾病活动度及干扰素疗效的关系

目的　了解丙型肝炎病毒 (HCV)准种变异与病毒血症水平、疾病活动度及干扰素疗效的关系。方法　采用针对HCVE2高变区 1 (HVR1 )的单链构象多态性分析法 (SSCP)对 68例慢性丙型肝炎患者进行HCV准种检测 ,分析准种数目与HCVRNA、ALT、AST水平及肝组织活动指数 (HAI)的相关性。对其中 48例给予干扰素治疗 ,分析准种数目对干扰素应答效果的影响。结果　 61例HVR1SSCP阳性 ,HCV准种数目为 (6 2± 2 4)条。准种数量与HCVRNA水平显著相关 (P <0 0 1 ) ,与ALT、AST及HAI无明显相关 (P >0 0 5)。干扰素治疗患者中 ,43例HVR1阳性 ,持续应答者治疗前HCV准种数量 (3 3± 1 2 ,n =1 1 )显著少于获得治疗终点应答 (ETR)伴复发者 (6 3± 2 2 ,n =1 2 ,P <0 0 5)或无应答者 (8 0± 3 3 ,n=2 0 ,P <0 0 1 )。治疗结束时 ,干扰素组仍有 1 6例检测出HCV准种 ,但准种条数降为 (3 4± 1 2 )条 ,与未接受干扰素治疗病例的准种数目 (6 8± 2 5)相比差异有显著性 ,P <0 0 1 ) ,且其中 1 0例准种模式发生了改变。结论　HCV准种多样性可引起较高的病毒血症水平 ,但与疾病活动度无关 ;准种数目可作为预测慢性丙型肝炎干扰素疗效的指标。     

丙型肝炎病毒非结构区抗原制备及其相应抗体的检测

目的 研究丙型肝炎病毒非结构区３（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｄ ｒｅｇｉｏｎ３,ＨＣＶ－ＮＳ３）与丙型肝炎发病的关系,寻求一种可用于判断临床干扰素（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ,ＩＦＮ）治疗疗效的检测方法。方法 采用基因重组,以大肠埃岙菌表达,提取ＨＣＶ－ＮＳ３不同末端蛋白作为抗原,并回顾性的对ＩＦＮ治疗的６３例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性的丙型肝炎患者血清用免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ     

Amino acid substitutions in NS5A region of GB virus C and response to interferon therapy

GB virus C (GBV-C) is related to hepatitis C virus (HCV) and has a similar genomic structure. Some predictors for the efficacy of interferon (IFN) therapy on HCV have been reported: genotype, viral load, IFN dose, and the amino acid substitutions in the NS5A region, designated as the interferon sensitivity determining region (ISDR). To evaluate the correlation between the amino acid substitutions in the GBV-C NS5A region and the response to IFN therapy, single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis was performed in the 12 concomitantly GBV-C-and HCV-infected patients who received IFN therapy at three time points: before, end-point, and after the IFN therapy. The region in the GBV-C NS5A studied includes the amino acids that exhibit some homology to the ISDR and the various substitutions. By SSCP analysis, amplicons were separated into 1-4 bands, which indicated the existence of heterogeneity in each host. However, the deduced amino acid sequences in these bands exhibited no characteristic differences among these strains irrespective of response to IFN therapy. Of the 32 strains separated by SSCP, 7 strains were responders, and 25 were nonresponders. The mean amino acid substitution, compared with the consensus sequence of nonresponders, was 1.00+/-0.93 among responders, and 1.40+/-0.85 among non-responders (P= NS). No correlation between the amino acid sequence in the GBV-C NS5A region and response to IFN therapy was found, indicating that the GBV-C NS5A region dose not act as the ISDR.     

Hepatitis C virus E2 and NS5A region variability during sequential treatment with two interferon-alpha preparations

To determine the pattern and significance of the HCV genetic heterogeneity before and during treatment with recombinant-2b or lymphoblastoid alpha-interferon, hypervariable region 1 (HVR-1) and NS5A quasispecies were characterised by cloning and sequencing in 12 HCV-1b-infected subjects. Patients were either responder-relapsers or non-responders to treatment. Extensive amino acid sequence analysis was applied to reveal the significance of HCV variation at key sites within HVR-1 and NS5A regions. Genetic complexity, genetic diversity, and the non-synonymous to synonymous substitution ratios of HVR-1 quasispecies decreased during treatment in responder-relapser patients only, and more markedly so following lymphoblastoid alpha-interferon. In non-responders, the HVR-1 quasispecies broadened. Amino acids G406 and Q409, which represent a major viral epitope, were highly conserved throughout treatment. Responder-relapser patients had a higher mutation frequency in NS5A than non-responders. Lymphoblastoid alpha-interferon promoted the selection of intermediate Interferon Sensitivity Determining Region (ISDR) sequences, whereas recombinant-2b alpha-interferon favoured maintenance or selection of conserved ISDR sequences. Variability upstream of the ISDR was associated with treatment response, but the amino acid substitutions conferring higher replicative ability to in vitro HCV replicons were absent in in vivo isolates. In conclusion, the pattern of HVR-1 quasispecies evolution correlates with the clinical response, and the conservation of specific amino acids may be useful for immune targeting in vivo. In responder-relapser patients, the initial HVR-1 evolution resembles that found in sustained responders. Variability within the entire NS5A, as opposed to a single region (ISDR), may have a role in influencing alpha-interferon treatment outcome. A differential effect of different alpha-interferon preparations on HCV quasispecies kinetics may exist.