甲型副伤寒杆菌nmpC基因原核表达及表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因nmpC的原核表达系统,确定其重组表达产物rNmpC免疫原性和保护作用,了解甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.方法 采用PCR和T-A克隆法从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中获得nmpC基因克隆并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rNmpC表达情况及其产量,采用免疫扩散法、Western blot和微量肥达试验鉴定其抗原性和免疫应答性.采用PCR和ELISA分别检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.采用小鼠感染模型了解rNmpC对甲型副伤寒杆菌致死性感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的nmpC基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rNmpC表达量约为细菌总蛋白的30%.rNmpC免疫家兔可产生抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号.所有甲型副伤寒杆菌菌株均携带nmpC基因并表达NmpC蛋白,但伤寒杆菌、乙型及丙型副伤寒杆菌未检出nmpC基因.100μg和200μgrNmpC对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和66.7%(8/12).rNmpC免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清仅对甲型副伤寒杆菌H抗原产生1∶5～1∶40的凝集效价.结论 NmpC是甲型副伤寒杆菌独有的序列保守、分布广泛且自然表达的外膜蛋白抗原,该外膜蛋白具有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为多价甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因及其原核表达系统,确定重组表达产物rSpaO-OmpA免疫保护作用.方法 采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因,构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO-OmpA表达情况及其产量.采用免疫扩散法、微量肥达和Western blot法鉴定rSpaO-OmpA 抗原性和免疫反应性.采用小鼠感染模型了解rSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用,实验中采用重组表达的SpaO( rSpaO)及OmpA(rOmpA)作为对照.结果 所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％.所构建的原核表达系统E.coli BL21 DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA.rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号,免疫家兔后可产生特异性抗体.100 μg或200 μgrSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66.7％ (8/12)和83.3％ (10/12),明显高于等量rSpaO及rOmpA( P＜0.05).rSpaO-OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1∶5 ～ 1∶40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO-OmpA免疫双扩散效价为1∶1 ～1∶16.结论 人工融合重组抗原rSpaO-OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强.     

甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白H1a基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫原性和保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌（Salmonella paratyphi A）H1a基因原核表达系统，确定表达产物rH1a免疫原性和保护作用，检测甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达情况。方法 采用高保真PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增H1a基因，T-A克隆后测序，构建H1a基因原核表达系统pET32a-H1a-E．coli B121DE3。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查rH1a表达情况，Ni-NTA亲和层析法收集rH1a。采用Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性。建立PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达频率。观察rH1a对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较，所克隆的H1a基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为99．59％。rH1a表达量为细菌总蛋白的60％左右。甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rH1a并与之结合。rH1a免疫家兔可产生抗体。100％（98／98）甲型副伤寒杆菌临床菌株均含有H1a基因并表达H1a。500μg rH1a灌喂或皮下注射免疫小鼠受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率均为50．0％，若加入5μg rLTB，存活率分别上升至75．0％和66．7％。结论 本研究成功地从甲型副伤寒杆菌临床菌株中构建了H1a基因高效原核表达系统。rH1a有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用。甲型副伤寒杆菌临床菌株广泛存在H1a基因并高频率表达。     

问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定

目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.     

幽门螺杆菌GroEL蛋白重组表达及表达产物小鼠免疫保护作用

目的 检测幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列差异,确定重组表达的GroEL蛋白(r-GroEL)抗原性、免疫反应性以及对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性.方法 采用PCR及测序法了解幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列.构建幽门螺杆菌groEL基因pET42a-E.coli BL21DE3原核表达系统,采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统确定rGroEL表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.采用ELISA和Western blot检测rGroEL的抗原性和免疫反应性,采用幽门螺杆菌全菌为包被抗原的ELISA确定GroEL膜定位.采用幽门螺杆菌小鼠感染模型了解rGroEL免疫保护作用.结果 35株幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列相似性高达99.4％～ 100％.rGroEL表达量可达细菌总蛋白的56％,SDS-PAGE后提纯的rGroEL在凝胶中显示为单一的条带.rGroEL可诱导家兔和小鼠产生高效价IgG抗体,同时也能被幽门螺杆菌全菌抗体(Hp-IgG)或rGroEL-IgG识别并与之结合.GroEL是幽门螺杆菌表面蛋白抗原.50、100或200 μg rGroEL免疫可分别使50.0％ (6/12)、75.0％ (9/12)和91.7％ (11/12)小鼠免于幽门 螺杆菌SS1株的感染,200 μg rGroEL免疫保护率(91.7％)显著高于50μg rGroEL(50.0％)( P＜0.05).结论 幽门螺杆菌GroEL蛋白是序列保守、具有良好免疫原性和免疫保护性的表面抗原,可作为基因工程疫苗候选抗原.     

问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白;采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价;Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在;重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.     

铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

目的 分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐约性关系.方法 采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段,T-A克隆后测序.构建phoQ和phoP基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的 重组表达产物rPhoQ和rPhoP,皮内注射免疫法制备兔抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价.采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ基因,采用PCR、测序和Western blot对phoQ突变株进行鉴定.采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度(MIC).结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的phoP和phoQ基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%～99.6%和98.7～100%、98.4%～99.8%和99.1%～100%.采用pET-42a和E. coli BL21DE3系统成功地表达了rPhoQ和rPhoP.rPhoQ和rPhoP兔抗血清免疫双扩效价分别为1:4和1:8抗血清.经PCR、测序和Western blot鉴定,两株phoQ突变株phoQ基因及产物均缺失.上述phoQ突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1/512～1/2048.结论 PhoQ/PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号转导系统,该系统介导细菌对氨基精苷类抗生素的耐药性.     

铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

目的 分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐约性关系.方法 采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段,T-A克隆后测序.构建phoQ和phoP基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的 重组表达产物rPhoQ和rPhoP,皮内注射免疫法制备兔抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价.采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ基因,采用PCR、测序和Western blot对phoQ突变株进行鉴定.采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度(MIC).结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的phoP和phoQ基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%～99.6%和98.7～100%、98.4%～99.8%和99.1%～100%.采用pET-42a和E. coli BL21DE3系统成功地表达了rPhoQ和rPhoP.rPhoQ和rPhoP兔抗血清免疫双扩效价分别为1:4和1:8抗血清.经PCR、测序和Western blot鉴定,两株phoQ突变株phoQ基因及产物均缺失.上述phoQ突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1/512～1/2048.结论 PhoQ/PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号转导系统,该系统介导细菌对氨基精苷类抗生素的耐药性.     

幽门螺杆菌alpA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析

目的:在乳酸菌中表达幽门螺杆菌(Hp)黏附素al-pA基因,口服免疫小鼠后检测其免疫原性。方法:PCR方法从基因组中扩增alpA基因,将其克隆至表达载体pNICE:sec,将重组质粒转化乳酸菌NZ9000株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的alpA蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。将雌性ICR(CV级)小鼠随机分为4组,分别用PBS、携带空质粒的乳酸菌、携带pNICE:sec-alpA的乳酸菌、灭活的Hp灌胃。免疫7次后检测其特异性IgG和IgA的产生。结果:扩增alpA基因并构建了重组原核表达质粒pNICE:sec-alpA,转化乳酸菌NZ9000后经nisin诱导可表达Mr约56 000的重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的9.6%,Western blot分析其能与幽门螺杆菌抗血清特异性反应,具有良好的免疫原性。携带pNICE:sec-alpA质粒的乳酸菌刺激产生的IgG水平明显高于携带空质粒组,与灭活Hp组没有明显的差异,但其刺激产生的IgA水平明显高于其他组(P0.05)。结论:表达al-pA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后,能够刺激小鼠产生特异的IgG和IgA,可作为幽门螺杆菌口服疫苗候选抗原。为乳酸菌作为抗原递送载体的研究和Hp口服疫苗的开发提供一定的实验基础。     

致肾盂肾炎大肠埃希菌新基因R049免疫保护作用的研究

目的 克隆和表达致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)132新基因R049,研究R049重组蛋白对小鼠的免疫保护作用. 方法 利用PCR定向克隆方法构建R049基因原核表达系统,表达后通过镍亲和层析纯化获得R049重组蛋白,制备鼠多克隆抗体.重组蛋白与UPECl32全菌蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,继而R049重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用同源菌对小鼠经尿道上行感染,比较免疫组与对照组小鼠尿液与肾脏细菌计数差异. 结果 成功构建重组株E.coli BL21(DE3)/pET32a-R049 ORF,重组蛋白相对分子质量(M,)约为66.9×103,纯化后其纯度达到95%,制备多克隆抗体效价为≥l:102 400.Western blot证实重组R049蛋白与UPECl32全菌蛋白均能与小鼠抗血清发生特异性反应.动物实验结果表明尿液和肾脏菌落计数在免疫组均明显低于对照组(P相似文献   

Differentiation of spotted fever group rickettsiae by sequencing and analysis of restriction fragment length polymorphism of PCR-amplified DNA of the gene encoding the protein rOmpA.

Currently, the genotypic identification of the spotted fever group (SFG) rickettsiae is based on restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified genes coding for the enzyme citrate synthase and the surface proteins rOmpA and rOmpB. A set of useful restriction endonucleases was found following comparison of Rickettsia rickettsii and R. prowazekii sequences. However, by using three PCR amplifications and four enzyme digestions with this set, it was impossible to differentiate between all of the known serotypes of the SFG rickettsiae. We amplified by PCR and sequenced using an automated laser fluorescent DNA sequencer a fragment of the gene encoding the protein rOmpA from 21 serotypes of the SFG rickettsiae. A 632-bp amplification product was obtained for most of the strains, although no product could be obtained by using R. akari, R. australis, R. helvetica, and R. bellii DNAs. We found a characteristic sequence for all strains studied except the two isolates of R. massiliae, isolates GS and Mtul. Using the software package BISANCE, we determined the restriction map of this fragment and identified five potentially useful endonucleases, RsaI, AluI, PstI, XbaI, and AvaII. We confirmed the computer analysis-derived profiles by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis. The combination of the profiles obtained after digestion of the PCR product by RsaI and PstI allowed for the differentiation of 16 strains. The use of AluI and XbaI allowed for the characterization of R. parkeri and strain HA-91, respectively. R. africae and strain S were differentiated by AvaII digestion. Thus, using a single PCR amplification, we were able to differentiate all of the SFG rickettsiae whose ompA gene was amplified by PCR.     

原核增强子样序列的筛选及其应用研究

目的 从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选原核增强子样序列,构建携带原核增强子样序列的表达载体,探讨其对干扰素基因表达的影响.方法 采用氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）作为报告基因,从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选具有原核增强子样活性的序列,构建携带增强子样序列的表达载体,表达干扰素基因和检测干扰素活性.结果 从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选到一个原核增强子样序列3A,其正、反向增强活性分别能提高β-半乳糖苷酶活性7.11和2.93倍.证实它的增强活性体现在转录水平;用原核增强子样序列3A的功能区3P3构建的表达载体,其表达的IFN-α2b型干扰素比原表达载体活性高3.7倍.结论 从大肠埃希菌C600株染色体基因组中筛选到一个原核增强子样序列3A,携带有原核增强子样序列的表达载体可提高干扰素基因的表达水平.     

炭疽杆菌培养上清液抗原的制备及免疫保护效果测定

目的 制备炭疽培养上清液抗原并对其免疫效果进行测定。方法将炭疽A16r菌种接种于培养基中培养，收集无菌滤液，并进行超滤浓缩，经Al（OH），佐剂吸附后，皮下免疫Balb／c小鼠，用炭疽Vollum（s）强毒株腹腔攻击测定其免疫效力。结果制备出具有高保护性的上清液抗原，9h产物对Balb／c小鼠免疫效果良好（94．4％）。结论本研究为进一步研究炭疽疫苗免疫保护机制和炭疽疫苗改进研究打下基础。     

表达pCDR1 Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建

目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链，在C端加上6-His标签，退火互补后插入原核表达载体pYA3149中，构建重组质粒pR1，将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550，获得杂合菌株X4550（pR1）。体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。体外诱导后6h细菌裂解上清液中，检测到表位肽的表达，该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合。重组菌株在体外营养选择压力下，可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。     

EB病毒gp85 N端片段的原核表达与初步鉴定

目的：构建EB病毒基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法：采用基因工程技术，以B95—8细胞（美洲绒猴外周血B淋巴细胞经EBV转化后的细胞系）培养上清为模板，用PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片段。PCR产物经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切，插入原核表达载体pGEX-5T中，构建pGEX5T-85N重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白用Westernblot鉴定，并免疫BALB／c小鼠。结果：序列分析表明，插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全一致。重组表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为45000，同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB／c小鼠，经ELISA检测获得了高效价的抗血清，且抗gp85单克隆抗体（mAb）可识别所表达的gp85N抗原。Westernblot显示，该抗原可与小鼠免疫血清起特异性反应。结论：表达并纯化的EB病毒截短的gp85N重组蛋白具有良好的抗原性，为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供了条件。     

Growth of Typhoid and Paratyphoid Bacilli in Intravenously Infected Mice

The in vivo growth of Salmonella paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C, and S. typhi, as well as of an S. typhi-typhimurium hybrid, was studied in three different strains of mice. S. paratyphi A and B and S. typhi demonstrated very little growth potential in any of the intravenously infected mice, even after as many as 20 serial mouse passages. It was noted, however, that small numbers of viable S. paratyphi B and S. typhi persisted in the spleens of infected mice for up to 28 days. Salmonella paratyphi C and the S. typhi-typhimurium hybrid gave rise to progressive systemic infections beginning from very small intravenous inocula. The median lethal doses for the C57B1 strain of mouse were about five organisms. The relevance of these findings with regard to the development of an animal model for studying human typhoid fever vaccines is discussed.     

A Live Recombinant Avirulent Oral Salmonella Vaccine Expressing Pneumococcal Surface Protein A Induces Protective Responses against Streptococcus pneumoniae

A live oral recombinant Salmonella vaccine strain expressing pneumococcal surface protein A (PspA) was developed. The strain was attenuated with Δcya Δcrp mutations. Stable expression of PspA was achieved by the use of the balanced-lethal vector-host system, which employs an asd deletion in the host chromosome to impose an obligate requirement for diaminopimelic acid. The chromosomal Δasd mutation was complemented by a plasmid vector possessing the asd⁺ gene. A portion of the pspA gene from Streptococcus pneumoniae Rx1 was cloned onto a multicopy Asd⁺ vector. After oral immunization, the recombinant Salmonella-PspA vaccine strain colonized the Peyer’s patches, spleens, and livers of BALB/cByJ and CBA/N mice and stimulated humoral and mucosal antibody responses. Oral immunization of outbred New Zealand White rabbits with the recombinant Salmonella strain induced significant anti-PspA immunoglobulin G titers in serum and vaginal secretions. Polyclonal sera from orally immunized mice detected PspA on the S. pneumoniae cell surface as revealed by immunofluorescence. Oral immunization of BALB/cJ mice with the PspA-producing Salmonella strain elicited antibody to PspA and resistance to challenge by the mouse-virulent human clinical isolate S. pneumoniae WU2. Immune sera from orally immunized mice conferred passive protection against otherwise lethal intraperitoneal or intravascular challenge with strain WU2.