肝癌细胞系Fas/FasL功能与免疫逃逸机制探讨

目的:探讨肝癌细胞通过Fas/FasL途径的免疫逃逸机制。方法:用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas及FasL的表达;用激活性Fas单克隆抗体CH11诱导细胞凋亡法检测肝癌细胞对Fas介导凋亡的抵抗;用HepG2.2.15与Jurkat细胞共培养法检测细胞表面FasL诱导T细胞凋亡的功能。结果:①HepG2.2.15细胞Fas表达低下,CH11不能诱导其凋亡;②FasL的表达率为18.03%,与Jurkat细胞共培养可诱导Jurkat细胞凋亡;③用中和抗体NOK-2封闭HepG2.2.15细胞表面FasL后,Jurkat细胞的凋亡率由21.41%降为8.91%。结论:肝癌细胞能抵抗Fas介导的凋亡,其表面的FasL可抑制T细胞的免疫功能,Fas/FasL途径是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一,可成为免疫治疗的新靶点。     

干扰素对人肝癌细胞株HepG2.2.15凋亡的影响

目的：探讨肝癌细胞株HepG2.2.15通过低表达Fas逃避免疫监视,以及干扰素α(IFN-α)通过上调Fas 表达对细胞凋亡的影响。方法：用流式细胞术检测肝癌细胞株HepG2.2.15的 Fas表达及IFN-α对其Fas表达的影响;用激活性Fas单克隆抗体CH11诱导细胞凋亡的方法,研究肝癌细胞对Fas介导凋亡的抵抗以及IFN α对肝癌细胞凋亡的影响。结果：① HepG2.2.15细胞低表达Fas,经浓度分别为2000、1000、　500U/ml的IFN-α作用后,Fas表达均显著增加(P均<0.001),且Fas表达率随IFN-α浓度的增加而增加;②CH11不能诱导HepG2.2.15细胞凋亡,IFN-α上调细胞Fas表达后,由CH11诱导的细胞凋亡增加(P均<0.01),且凋亡率随IFN-α浓度的增加而增加。结论：肝癌细胞HepG2.2.15能抵抗Fas介导的凋亡,IFN-α可通过上调细胞Fas表达,促进CH11诱导的肝癌细胞凋亡。     

绒癌中Fas/FasL的表达及其介导的细胞凋亡的意义

目的 研究Fas/FasL在绒毛膜癌细胞中的表达,及绒癌细胞与Jurkat细胞共培养诱导T细胞凋亡的机制.方法 用免疫荧光染色法检测绒癌细胞系Fas/FasL的阳性表达情况,MTT法检测随时间变化绒癌细胞对Jurkat细胞的抑制情况,流式细胞仪检测Jurkat细胞与绒癌细胞共培养24 h、中和抗体NOK-2封闭FasL 24 h Jurkat细胞的凋亡情况,透射电镜观察细胞的凋亡形态.结果 绒癌细胞上均有Fas及FasL的表达,在绒癌细胞上Fas的阳性表达较低,而FasL表达较多(P<0 05).绒癌细胞与Jurkat 细胞共培养可诱导Jurkat 细胞凋亡,绒癌细胞与Jurkat细胞共培养后随着时间的延长Jurkat细胞的凋亡率增加(P<0 05),出现特征性凋亡形态特征.用中和抗体NOK-2 封闭细胞表面FasL 后, Jurkat细胞的凋亡率下降.结论 两种绒癌细胞上均有Fas及Fasl的表达,绒癌细胞能抵抗Fas介导的凋亡,其表面的FasL可抑制T 细胞的免疫功能,Fas/FasL途径是绒癌细胞免疫逃逸的重要机制之一.     

乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.     

Fas和FasL在人绒癌细胞中的表达及其生物学意义

目的 观察Fas/FasL在绒毛膜癌细胞JEG-3、BeWo和Jurkat中的表达情况,探讨Fas/FasL与人绒癌细胞免疫逃逸的机制.方法 免疫荧光染色法、RT-PCR、免疫印迹检测fas/fasl的表达.台盼蓝细胞拒染、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测、流式细胞计数法检测绒癌细胞与Jurkat细胞共培养后对Jurkat细胞的抑制情况.结果 ①发现绒癌细胞上均有Fas及FasL表达;②与Jurkat细胞相比,在基因和蛋白水平,绒癌细胞中Fas表达低下,而FasL表达升高.③绒癌细胞与Jurkat细胞共培养可诱导Jurkat细胞存活率下降(P＜0.05),随共培养时间延长Jurkat细胞凋亡率升高(P＜0.05);④用中和抗体NOK-2封闭细胞表面FasL后,Jurkat细胞的凋亡率从(17.86±5.59)%下降到(6.88±1.05)%.结论 与Jurkat细胞相比绒癌细胞Fas表达下调而FasL的表达升高,证实Fas/FasL系统表达异常后可以使绒癌细胞逃离免疫监视.     

口腔鳞癌肿瘤浸润淋巴细胞的Fas/FasL表达

目的研究口腔鳞状细胞癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)Fas/FasL的表达及其临床病理学意义。方法采用免疫组织化学方法和脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)介导的原位末端标记(TUNEL)技术,对38例口腔鳞癌TIL的Fas/FasL表达及TIL和癌细胞的凋亡进行检测,观察TIL的Fas/FasL表达与TIL和癌细胞凋亡的关系。结果TIL的Fas和FasL均有广泛的表达,TILFas表达阳性组的TIL凋亡指数(AI)明显高于Fas表达阴性组(P<0.05),TILFasL表达阳性组的癌细胞凋亡指数与FasL表达阴性组差异无显著性(P>0.05)。结论口腔鳞癌TIL的Fas阳性表达与其凋亡有密切关系,而FasL的阳性表达则与癌细胞凋亡无关。癌细胞可能通过Fas凋亡系统诱导TIL的凋亡并通过某种机制逃避TIL的杀伤。     

趋化因子受体CXCR7在人肝癌细胞株中的表达及意义

目的探讨趋化因子受体(Chemokine receptor,CXCR7)在不同肝癌细胞株中的相对表达强度及意义。方法采用RT-PCR、Western blot法,检测8株不同转移潜能肝癌细胞中趋化因子受体CXCR7在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果 CXCR7在8株肝癌细胞中的表达水平差异存在统计学意义,无论是mRNA水平还是蛋白水平,高转移潜能肝癌细胞株(MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3)CXCR7的表达明显高于普通转移潜能肝癌细胞株(HepG2、PLC/PRF/5、SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B),P<0.01。结论 CXCR7与肝癌的发生、发展及预后有一定的相关性。     

野生型p53基因提高肝癌细胞化疗药物敏感性的实验研究

目的:研究野生型p53(wtp53)提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用.方法:采用p53基因型不同的三种人肝癌细胞株HepG2 (部分wtp53)、Hep3B(p53-/-)和 PLC/PRF/5(mtp53),观察携wtp53基因的重组腺病毒联合化疗药物争光霉素(bleomycin,bleo)、丝裂霉素(mitomycin, mito)或甲氨蝶呤(methotrexate, meth)对肝癌细胞的杀伤效应.结果:HepG2、Hep3B和 PLC/PRF/5分别耐受600 μg/ml bleo、100 μg/ml mito或1 000 μg/ml meth,但转入wtp53基因后再使用上述质量浓度范围的化疗药物,则肝癌细胞出现了明显的被杀伤效应.结论:wtp53基因能提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,wtp53基因联合化疗药物治疗可望开辟克服肝癌耐药的新途径.     

奥沙利铂诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡及其机制探讨

目的 :研究奥沙利铂对人肝癌细胞株HepG2生长抑制及诱导凋亡的作用并探讨其诱导凋亡的作用机制。方法 :应用MTT法检测奥沙利铂对HepG2细胞生长的抑制作用 ;电镜观察细胞的形态改变 ;流式细胞仪分析细胞周期的分布和凋亡的情况 ;免疫组织化学法检测突变型p5 3,Bcl- 2 ,Bax ,Fas等凋亡相关基因蛋白的表达。结果 :奥沙利铂对HepG2有明显的抑制作用 ,细胞阻滞于S期和G2 /M期 ,G0 /G1期细胞减少 ,作用 72h出现凋亡峰 ,电镜可以找到凋亡小体 ,免疫组织化学表明Bax表达增强 ,突变型 p5 3、Bcl- 2表达减弱 ,Fas表达无差异。 结论 :奥沙利铂具有抑制肝癌细胞株HepG2增殖及诱导凋亡作用 ,其机制与促凋亡相关基因表达增强和抗凋亡相关基因表达减弱有关。     

Fas通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活调控肝癌细胞增殖

目的 探究肿瘤坏死因子受体超族成员6(Fas)调控肝癌细胞株增殖的潜在分子机制。方法 收集正常肝细胞LO2和肝癌细胞株Hep3B、Huh7、PLC/PRF/5、Bel-7402、SMMC-7721、HepG2和SK-hep1,实时荧光定量PCR法检测Fas基因表达,运用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析Fas基因表达与肝癌的关系,设计特异性靶向Fas的siRNA,敲低肝癌细胞中Fas基因的表达,通过噻唑蓝(MTT)实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力,用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,双荧光素酶实验检测β-连环蛋白(β-catenin)介导的T细胞因子(TCF)/淋巴增强子(LEF)转录活性,蛋白质印迹法检测β-catenin蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt)/β-catenin信号通路下游靶基因八聚体结合转录因子3/4(Oct3/4);G1/S-特异性周期蛋白-D1(CCND1);血管内皮生长因子(VEGF);B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(Bmi)的表达。结果 TCGA肝癌样品中Fas基因表达谱结果显示,肝癌组织Fas ...     

昆明山海棠碱通过Fas受体介导途径诱导Jurkat淋巴瘤细胞株凋亡

目的 探讨Fas、caspase-8在昆明山海棠碱(THH碱)对Jurkat淋巴瘤细胞的凋亡诱导中的变化，以进一步研究THH碱诱导凋亡的分子机制。方法 采用Annexin—Ⅴ标记和流式细胞术检测细胞的凋亡发生率，采用western blotting分析FasL、caspase-7、caspase-8、Bid等蛋白表达的变化。结果 THH碱能有效诱导Jurkat细胞凋亡；在其凋亡过程中，FasL逐渐表达增强、caspase-7、caspase-8、Bid剪切激活，并呈时间依赖性。结论 THH碱通过Fas受体—配体介导激活caspase-8，caspase-8再激活caspase-7和Bid等网络途径诱导Jurkat细胞凋亡。     

黄芪皂苷对过氧化氢诱导的肺泡上皮细胞凋亡的作用

目的探讨黄芪皂苷对过氧化氢(H2O2)引起的肺泡上皮细胞凋亡的拮抗作用。方法采用Annexin V评价细胞凋亡,Westernblot检测细胞内Fas和FasL,分别对过氧化氢单纯刺激组,黄芪100 uM和200 uM孵育后过氧化氢刺激组进行检测。结果黄芪皂苷孵育组凋亡数明显少于单纯H2O2刺激组(P<0.01)。黄芪皂苷孵育组中Fas和FasL的表达较单纯H2O2刺激组减弱(P<0.01)。结论黄芪皂苷可有效减少由H2O2引起的肺泡上皮细胞的凋亡,减少Fas和FasL的表达。     

FasL在人肝门部胆管癌组织和胆管癌细胞中的表达及其对细胞凋亡的诱导作用

目的：研究FasL在人肝门部胆管癌组织和胆管癌细胞中的表达及其诱导细胞凋亡的能力,从而探索肝门部胆管癌免疫逃逸的机制。方法：运用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）、印迹杂交及免疫组织化学等方法,检测了胆管癌细胞株QBC939细胞和人肝门部胆管癌组织中FasL的表达;并用TUNEL技术和流式细胞仪检测了相关淋巴细胞的凋亡。结果：在所观测的48例手术切除的肝门部胆管癌组织中均发现FasL蛋白的表达,TUNEL 染色发现瘤周肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）有高水平的细胞死亡;在胆管癌的细胞中检测到FasLmRNA及蛋白的表达,并且可使共同培养的Jurkat细胞发生凋亡。结论：胆管癌可通过FasL诱导活化淋巴细胞的凋亡以逃避免疫监视。     

FasL及FasLASODN在舌鳞癌细胞免疫逃逸中的作用

目的：研究Fas配体（FasL）及FasL反义寡脱氧核苷酸（ASODN）在舌鳞癌细胞免疫逃逸中的作用。方法对人舌鳞癌细胞中FasL表达及功能进行检测,设计合成特异FasLASODN,转染舌鳞癌细胞,封闭舌鳞癌细胞的FasL表达。通过流式细胞术、逆转录聚合酶链反应（RT‐PCR）和四唑盐（MTT）等方法,观察基因‐蛋白‐细胞效应。结果通过RT‐PCR检测提示在脂质体的量一定的情况下,在一定范围内,ASO的浓度越高,转染效率越高。MTT／FCM结果显示ASO对SCC‐9细胞的增殖有明显的抑制作用（P＜0．05）。FCM对细胞凋亡的检测结果显示反义链组与正义链组、空白对照组及脂质体组相比,总凋亡率有明显差异（P＜0．05）。结论Fas／FasL途径是口腔鳞癌细胞免疫逃逸的重要机制之一,可作为免疫治疗的新靶点。     

8-Br-cAMP诱导人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞系的凋亡效应

目的：探讨8—Br—cAMP对人视网膜母细胞瘤HXO—Rb44细胞系的凋亡效应。方法：以8—Br—cAMP体外作用HXO—Rb44细胞，分为3个实验组和3个对照组，分别进行24h，48h和72h培养。应用RNA斑点印迹、免疫组化斑点印迹及原位杂交技术，分别对HXO—Rb44细胞的bcl—2杂交信号和PcNA、Fas、FasL表达信号进行检测。采用TUNEL法检测HXO—Rb44细胞的凋亡率。结果：在不同培养时间的实验组巾HXO—Rb44细胞的凋亡率明显高于各自的对照组(未经8—Br—cAMP处理)；而PCNA、Fas、bcl—2杂交信号扫描数值低于对照组，FasL杂交信号扫描数值高于对照组，尤以48h的作用最显著。结论：8—Br—cAMP可能是通过下调细胞内的bcl—2基因、Fas和PCNA的表达和上调FasL的表达而诱导HXO—Rb44细胞系凋亡。     

鼻息肉上皮细胞中Fas、FasL和Bcl-2的表达及其意义

其其发病学意义。方法:用免疫组化染色法检测鼻息肉组(29例)和下鼻甲组(11例)上皮细胞Fas、FasL、Bcl-2基因蛋白的表达。结果:鼻息肉组上皮细胞Fas、FasL和Bcl-2阳性细胞指数(PIFas、PIFasL、PIBcl-2)均大于下鼻甲组(P<0.01),PIBcl-2/PIFas也大于下鼻甲组(P<0.01),但鼻息肉组PIFasL/PIFas与下鼻甲组比无统计学意义;鼻息肉组PIFasL/PIFas和PIBcl-2/PIFas均大于1(理论值,P<0.05)。结论:Bcl-2介导的抑制细胞凋亡机制和FasL介导的细胞免疫逃逸机制可能对Fas/FasL系统介导的细胞凋亡产生部分抑制作用,有可能是鼻息肉上皮细胞增殖和细胞凋亡平衡失调的根本原因。     

奥曲肽诱导肝癌细胞凋亡和Fas/FasL的表达

目的 探讨奥曲肽对人肝癌细胞抑制作用的机制,为奥曲肽临床应用提供实验依据.方法 用奥曲肽4、7、10 μ g/ml作用人肝癌细胞株(SMMC-7721)24、48、72 h,以空白作为对照组;采用原位末端标记(TUNEL)法流式细胞仪检测SMMC-7721凋亡;直接标记单克隆(CD95/CDl78)抗体法流式细胞仪检测SMMC-7721 Fas/FasL表达的变化.结果 奥曲肽在4、7、10 μg/ml d作用 SMMC-7721 24 h后,SMMC-7721凋亡率从8%升高为40%(P＜0.05),Fas表达率从57%升高为76%(P＜0.05),FasL表达率从54%升高为63%(P＜0.05).结论 奥曲肽能诱导肝癌细胞(Hep SMMC-7721)凋亡的发生,而且能促进肝癌细胞Fas/Fasl基因的表达.     

幽门螺杆菌cagA蛋白及其疫苗候选抗原对T细胞Fas Ligand介导凋亡的调节作用

目的　评价幽门螺杆菌 (Hp)多种功能蛋白致T细胞凋亡的能力 ,以探求它们在Fas/FasL介导的机体T细胞耐受中的作用 ,为Hp疫苗研制寻求安全有效的免疫原。方法　应用JAM技术对cagA阳性Hp及同源基因突变株、重组尿素酶、粘附素HpaA及外膜蛋白Hop2 5、35、38致T细胞系凋亡的能力进行了比较 ;应用流式细胞术对上述因素特别是cagA阳性菌株诱导T细胞FasL表达的能力进行了检测 ;应用金属蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂分别提高和降低Hp介导的T细胞凋亡 ,以证实其与FasL合成的关系。结果　HpcagA阳性株无论在提高T细胞表达FasL还是在诱导T细胞凋亡方面的作用均强于同源基因突变株。Hp抗原制品中尿素酶对T细胞无杀伤能力 ,而Hop38毒性最强 ,Hop2 5、Hop35和HpaA等作用较弱。金属蛋白酶抑制剂提高了cagA阳性Hp致T细胞凋亡的能力 ,而蛋白合成抑制剂Emetine则通过抑制T细胞FasL表达而抑制了Hp介导的T细胞凋亡。结论　cagA蛋白及Hop38能通过调节FasL表达造成T细胞耐受 ;尿素酶、外膜蛋白Hop2 5、Hop35和HpaA不会通过抑制T细胞而导致耐受机制的发生 ,因而可安全应用于疫苗研制。