PI3K对IL-8／Rac1信号通路介导的内皮细胞迁移的影响

目的研究磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）对IL-8／Rac1信号通路所介导的内皮细胞迁移的影响。方法选择P13K抑制剂wortmannin及划痕创伤愈合修复分析,研究不同wortmannin的作用浓度和不同时间对IL-8／Rac1信号通路诱导的内皮细胞迁移的影响。结果不同wortmannin的作用浓度和不同时间预处理均可抑制IL-8／Rac1信号通路介导的内皮细胞迁移,其中wortmannin预处理浓度为100nmol／L,预处理时间为20min时IL-8诱导的内皮细胞迁移水平最低。结论P13K能够影响IL-8／Rac1信号通路介导的内皮细胞迁移;P13K抑制剂wortmannin的最佳作用浓度为100nmol／L,最佳作用时间为20min。     

力-化学耦合作用在血管内皮细胞迁移中的作用及其力学生物学机制

目的 研究力学与化学因素的耦合在内皮细胞迁移过程中的作用以及其中的力学生物学机制。方法 在不同大小剪应力下分别用RTPCR、Western blot以及免疫荧光的方法检测内皮细胞CXCR1和CXCR2的表达变化;用antiIL8RA和antiIL8RB拮抗CXCR1和CXCR2,在剪应力作用下观察内皮细胞迁移情况;采用脂质体包绕法分别将Rac1及RhoA的野生型、活化型和抑制型3种质粒转染入内皮细胞,将转染了Rac1的3种质粒的细胞分别施加力学（剪应力）和化学（IL-8）刺激,对转染了RhoA的3种质粒的细胞施加化学刺激,检测以上条件下内皮细胞迁移情况。结果 CXCR1和CXCR2作为新型力学感受器参与调节内皮细胞迁移;Rac1与RhoA的高表达能促进内皮细胞迁移,反之,内皮细胞迁移被抑制。结论 IL-8Rs (CXCR1、CXCR2)、Rac1、RhoA是将力学、化学信号进行“耦合”的关键信号分子。     

IL-8诱导血管内皮细胞迁移的实验研究

为了探讨不同浓度IL-8诱导的血管内皮细胞迁移从而为进-步研究IL-8引起血管内皮细胞迁移的分子机理选择最佳的IL-8浓度。采用内皮细胞transwell小室迁移率分析法和刮除-迁移分析法，考察IL-8对血管内皮细胞迁移的影响。结果表明，各种浓度的IL-8均可促进血管内皮细胞迁移，其中以IL-8浓度为100ng／ml时内皮细胞迁移率最高。     

粘着斑激酶在血管内皮细胞黏附和迁移中的作用

目的 采用粘着斑激酶（focal adhesion kinases,FAK)抑制剂抑制FAK在Y397位点的酪氨酸磷酸化,测定不同浓度的FAK抑制剂的对内皮细胞黏附、迁移及下游信号Rac1蛋白表达的影响,探索粘着斑激酶在内皮细胞黏附和迁移中的作用。方法 运用内皮损伤模型（划痕法）测定FAK抑制剂在2、4、8、24 h各时间点对EA.hy 926细胞迁移的影响。Western blot结合免疫荧光测定不同浓度的0~250 nmol/mL的FAK抑制剂的加入对Rac1蛋白分布和表达的影响。结果 随着FAK抑制剂浓度的增加,细胞迁移距离减少,Rac1蛋白表达逐渐减弱。结论 抑制FAK的磷酸化将抑制内皮细胞的黏附和迁移的生物学行为,下游Rac1蛋白表达降低。内皮细胞的黏附和迁移与FAKRho GTPases 信号轴相关。     

转录因子Bach1对人微血管内皮细胞的作用研究

 目的:研究转录因子Bach1对人微血管内皮细胞功能的影响。方法: 利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）细胞转染技术下调内皮细胞Bach1表达;用Matrigel管腔形成实验检测内皮细胞体外血管新生的能力;用Transwell小室法检测细胞迁移;用CCK-8法测定细胞增殖;用实时荧光定量PCR、Western blotting和ELISA法检测细胞中血红素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）mRNA 和蛋白的表达情况;用转染报告基因的方法检测VEGF基因的转录活性。结果: 下调内皮细胞Bach1表达明显促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成能力,对内皮细胞增殖能力无明显影响;抑制Bach1表达促进内皮细胞HO-1 mRNA 和蛋白的表达,增加VEGF 转录活性及mRNA和蛋白的表达。结论: 抑制转录因子Bach1表达可增加内皮细胞HO-1和VEGF的表达,促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成,提示Bach1是负性调控血管新生的因子。     

流体低切应力对内皮细胞IL—8mRNA表达的影响

为证实内皮细胞IL-8表达不仅受化学因子的调节,而且还受力学因素的影响。我们用低层流切应力（4.2dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞后采用RT-PCR法检测内皮细胞IL-8基因表达,并用免疫细胞化学染色法检测内皮细胞内NF-kB激活的影响,结果发现：①未用切应力处理和切应力作用0.5h后内皮细胞IL-8mRNA表达量很少,切应力作用1h后内皮细胞IL-8 mRNA表达增加,2h进一步增加。②未用切应力处理和切应力作用0.5h内皮细胞核内NF-kBp65染色阴性,切应力作用1h呈弱阳性,2h呈阳性。提示低层流切应力可诱导内皮细胞表达增加,IL-8表达量与切应力作用时间有关。流体切应力可诱导内皮细胞内NF-kB的激活,激活程度与作用时间有关。低切应力诱导内皮细胞表达IL-8,可能在急性炎症和动脉粥样硬化发生、发展过程中具有重要作用。     

流体切应力作用时间对内皮细胞IL-8 基因表达的影响

内皮细胞对力学环境变化敏感，流体切应力可以直接调节内皮细胞基因的表达。为阐明内皮细胞白细胞介素-8（IL-8）基因的表达除受化学因子的调节外还受力学因素的影响，本文用流体切应力（2.23、4.20、6.08dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞，然后采用定量RT-PCR的方法检测内皮细胞IL-8基因的表达情况。结果显示：未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达；切应力处理内皮细胞后，1h IL-8mRNA表达增加，2hIL-8mRNA表达量至最高值，3hIL-8mRNA表达量开始下降，4h后IL-8mRNA持续低表达；各实验组（2.23、4.20、6.08dyne/cm^2）均表现出相同的IL-8mRNA随时间的变化规律。提示流体切应力确可诱导内皮细胞表达IL-8，而且IL-8的表达量与切应力作用时间有关，呈双相性变化。流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8，可能在急性炎症和动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用。     

肺炎衣原体感染通过PI3K激活Rac1而诱导血管平滑肌细胞迁移

 目的:研究Rac1活化在肺炎衣原体（C.pn）感染诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移中的作用及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）对其活化的影响。方法:谷胱甘肽巯基转移酶（GST）-p21活化激酶1 p21结合结构域（PBD）即GST-PBD重组质粒转化感受态细菌,诱导融合蛋白表达并纯化;GST-pull down实验检测C.pn感染VSMCs后Rac1活性的变化;PI3K特异性抑制剂LY294002 （25 μmol/L）预处理VSMCs,GST-pull down实验检测Rac1活性的变化;Rac1特异性抑制剂NSC23766（50 μmol/L）预处理VSMCs,wound-healing 实验和Transwell 实验观察VSMCs迁移能力的变化。结果:重组质粒转化感受态细菌后,经诱导表达和纯化,得到足量有效的GST-PBD融合蛋白;GST-pull down实验结果显示,C.pn感染VSMCs后Rac1活性增强且显著高于正常对照组（P<0.05）;LY294002预处理VSMC后,C.pn感染诱导的Rac1活性明显下降（P<0.05）;细胞迁移实验结果显示,NSC23766预处理的 C.pn感染组细胞迁移能力明显低于单纯感染组（P<0.05）。结论: C.pn感染可能通过PI3K激活Rac1,从而诱导VSMCs迁移。     

流体剪应力对EA.Hy926细胞IL-8受体mRNA表达的影响

为研究EA．Hy926细胞在不同时间、不同大小流体剪应力作用下IL-8受体CXCR1、CXCR2 mRNA的表达规律,通过体外培养人脐静脉内皮细胞株EA．Hy926细胞,分别施加5．56、10．02、15．27 dyn／cm2三种剪应力,选取剪切5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min、1、2、4和8 h等10个时间点进行观测,以半定量RT- PCR方法检测IL-8受体mRNA表达变化。结果表明,在5．56 dyn／cm2剪应力作用下,与静止组相比,各时间点CXCR1 mRNA与CXCR2 mRNA表达均显著升高(P<0．05)。在10．02 dyn／cm2剪应力作用下,CXCR1 mRNA表达随时间相对缓慢下降;而CXCR2 mRNA表达在30min出现短暂的升高,然后随着作用时间的延长开始缓慢下降。在15．27 dyn／cm2剪应力作用下,其CXCR1、CXCR2 mRNA的表达随时间呈现较显著性降低(P<0．01),当持续作用4 h以上其CXCR2 mRNA表达极低。以上结果表明,不同强度、作用时间的流体剪应力参与调节IL-8受体表达。     

TNF—a对内皮细胞白介素—8基因表达的影响

IL-8作为一种趋化细胞因子在炎症反应中具有重要作用，其在内皮细胞内的表达受多种细胞因子的调节。本文用TNF-a孵育培养的人脐静脉内皮细胞不同时间后，用RT-PCR法检测内皮细胞内IL-8mRNA的表达，并用免疫细胞化学染色法检测内皮细胞内NF-kB的激活。结果发现：（1）未用TNF-a孵育的内皮细胞IL-8表达量很少，TNF-a孵育1小时后IL-8表达明显增加，3h进一步增加；6h IL-8表达降低，9h进一步降低至基础水平；（2）未用TND-a孵育的内皮细胞核NF-kB p65免疫细胞化学染色呈阴性，NF-a孵育1，3h后NF-kB p55免疫细胞化学染色呈阳性，6h时后呈弱阳性，9h后呈阴性。提示：TNF-a可诱导内皮细胞表达IL-8并可激活内皮细胞内NF-kB，二者的时相过程基本一致。作者认为TNF-a诱导IL-8在内皮细胞内表达可能与转录因子NF-kB的激活有关。     

纤维蛋白对大鼠脑血管内皮细胞白细胞介素6表达的影响

目的：观察纤维蛋白对离体培养的大鼠脑血管内皮细胞白细胞介素6（IL-6）转录及蛋白水平表达的影响。方法：大鼠脑血管内皮细胞分离后培养，加入不同浓度的纤维蛋白，通过real-time PCR检测脑血管内皮细胞中IL-6转录水平，应用酶联免疫方法(ELISA)定量检测培养基和细胞裂解液中的IL-6水平。结果：加入不同浓度（0.03 g/L、0.1 g/L、0.3 g/L和1.0 g/L）的纤维蛋白24 h后，1.0 g/L纤维蛋白组的培养基中IL-6水平显著增高（P<0.01）；然后加入1.0 g/L纤维蛋白2、4、8、24 h，培养基中的IL-6水平均显著升高（P<0.05）；而加入不同浓度的胶原蛋白不引起IL-6水平的明显变化；real-time PCR结果显示，脑血管内皮细胞IL-6 mRNA的上调呈现出剂量和时间依赖性增加。结论：纤维蛋白是血管内皮细胞活化剂，可以上调大鼠脑血管内皮细胞中IL-6的表达，在蛋白和mRNA均呈现出剂量和时间依赖性增加。     

Migration through basement membrane modulates eosinophil expression of CD44

BACKGROUND: Tissue eosinophils express more membrane receptors and release more mediators than blood eosinophils, suggesting that migration from blood to tissue modulates eosinophil phenotype and functions. OBJECTIVE: We postulated that eosinophil passage through endothelial basement membrane, an important step of eosinophil migration into tissue, may be responsible for some of these changes. METHOD: We previously showed that 5-oxo-6, 8, 11, 14-eicosatetraenoic acid (5-oxo-ETE) in combination with IL-5 promotes eosinophil migration through Matrigel, a mouse tumour cell-derived basement membrane. Using this model, we evaluated the effect of trans-Matrigel migration on purified human blood eosinophil expressions of CD44, CD69 and HLA-DR that either increase or appear on activated eosinophils, and releases of peroxidase (EPO), leukotriene (LT) C(4) and granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF). RESULTS: IL-5, but not 5-oxo-ETE, increased eosinophil expression of CD44 and CD69. Migration of eosinophils through Matrigel significantly increased CD44 expression level over the one induced by IL-5 (P = 0.0001). Migration through Matrigel did not modify CD69 expression compared with the one obtained in the presence of IL-5 alone; however, incubation of eosinophils on Matrigel decreased IL-5-induced CD69 (P = 0.0001). Trans-Matrigel migration did not modify HLA-DR expression, nor EPO, LTC(4) and GM-CSF releases. CONCLUSION: These data show that in vitro trans-Matrigel migration and Matrigel contact modulate eosinophil membrane receptor expression. Consequently, they suggest that migration through basement membrane mediates changes in cell-surface phenotype observed on activated eosinophils and probably prepares them for interactions with tissue components and cells.     

高浓度的糖刺激人肾小球内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白-1的影响

目的 :探讨高浓度的糖对培养的人肾小球内皮细胞 (HUGEC)表达单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)的影响 ,以及HUGEC的条件培养基对单核细胞 (MC)的趋化作用及抗MCP 1抗体对MC迁移的影响。方法 :采用原位杂交技术和细胞ELISA法 ,观察MCP 1的表达 ;用改良的Boyden小室微孔滤膜法 ,测定高浓度的糖刺激HUGEC后的条件培养基 ,对MC的趋化作用 ,以及抗MCP 1抗体对MC迁移的影响。结果 :(1)在低浓度的糖(含 5 .5mmol/LD 葡萄糖 )条件下培养的HUGECMCP 1mRNA呈弱表达。高浓度的糖 (含 2 5mmol/LD 葡萄糖 )刺激后 ,8h即出现MCP 1表达增强 ,于 16h达高峰。(2 )高浓度的糖刺激HUGEC后的条件培养基 ,对MC具有明显的趋化作用 ;抗MCP 1抗体可抑制其作用。结论 :在高浓度的糖诱导下 ,人HUGECMCP 1的表达增强 ,其条件培养基对MC具有趋化作用 ,从而可能招引单核细胞迁入内皮下间隙。     

Functional re-expression of CCR7 on CMV-specific CD8+ T cells upon antigenic stimulation

During latency circulating human cytomegalovirus (CMV)-specific CD8(+) T cells do not express the chemokine receptor CCR7. We here show that antigen-specific stimulation in vitro with the specific CMV-peptide in combination with CMV-antigen, IL-2 or IL-21 induced re-expression of CCR7 on CMV-specific CD8(+) T cells. Although IL-15 induced strong proliferation of peptide-pulsed CMV-specific CD8(+) T cells, these cells did not re-express CCR7. CMV-specific cells that re-expressed CCR7 also expressed CD62L and were able to react to specific chemokine stimulation with changes in the cytoskeleton. In addition, activated CMV-specific cells specifically migrated towards a chemokine gradient in a transwell assay, with and without an endothelial cell monolayer. We conclude that antigenic stimulation induced functional re-expression of CCR7 which suggests that the migratory properties of virus-primed T cells are flexible and depend on the presence or absence of antigen and cytokines.     

人脐带间充质干细胞分泌白细胞介素6促进骨肉瘤细胞增殖和迁移

 目的: 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对骨肉瘤Saos-2细胞增殖和迁移的作用及分子机制。方法: 组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs,流式细胞术鉴定细胞表面标记物;CCK-8法和细胞计数法检测hUC-MSCs条件培养基(CM)、重组人白细胞介素6(rhIL-6)及IL-6中和抗体对Saos-2细胞增殖的作用;ELISA检测hUC-MSCs分泌IL-6的量;RT-PCR检测增殖相关基因增殖细胞核抗原(PCNA)、cyclin D1和survivin的转录水平;Transwell实验检测hUC-MSCs和Saos-2细胞迁移能力的变化。结果: hUC-MSCs可向Saos-2细胞迁移;hUC-MSCs-CM含有高浓度的IL-6,可达(1 835.5±134.1)ng/L;hUC-MSCs-CM和rhIL-6均能促进Saos-2细胞增殖和迁移,IL-6中和抗体能明显削弱hUC-MSCs-CM的促Saos-2细胞增殖和迁移作用;RT-PCR显示hUC-MSCs-CM和rhIL-6均能上调Saos-2细胞增殖相关基因PCNA、cyclin D1和survivin的表达,而IL-6中和抗体则削弱了这一作用。结论: 脐带间充质干细胞能向骨肉瘤Saos-2细胞迁移,并通过分泌IL-6促进其增殖和迁移。