SMAD家族成员4 shRNA干扰慢病毒构建与分析

目的制备shRNA干扰人SMAD家族成员4(SMAD4)的慢病毒载体(shRNA-SMAD4),为深入研究BMPs/SMAD信号通路奠定基础。方法利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计,根据小干扰RNA的设计原则,选取3对针对SMAD4特异性干扰引物而合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒pSIH1-H1,形成pSIH1-H1-shRNA-SMAD4质粒。用PCR及测序对其鉴定,然后与慢病毒包装质粒混匀,由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装,产生慢病毒shRNA-SMAD4,并收集上清液感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR及Western Blot鉴定重组慢病毒干扰效果。结果(1)shRNA干扰SMAD4特异性引物的获得。(2)pSIH1-H1-shRNA SMAD4质粒经PCR验证和测序后,证实构建成功。(3)shRNA-SMAD4在HEK293T中重组成慢病毒,并成功感染MDA-MB-231。(4)shRNA-SMAD4感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后SMAD4的表达降低。结论成功构建shRNA-SMAD4慢病毒载体,并能有效抑制SMAD4表达。     

三阴乳腺癌细胞受体相互作用蛋白140的表达与癌细胞生长和增殖的相关性

目的探讨受体相互作用蛋白140(RIP140)在三阴乳腺癌组织中的表达及其对癌细胞生长和增殖的影响。方法选取2005年2月至2008年2月该院行乳腺癌改良根治手术的患者179例,均能电话随访且术前均未行放射治疗或者化疗。其中,术后诊断三阴乳腺癌41例,非三阴乳腺癌138例,各取癌旁组织10例。采用免疫组织化学法和Western Blot检测3种组织的RIP140表达;慢病毒介导MDA-MB-231细胞RIP140沉默,将RIP140沉默后的MDA-MB-231细胞作为实验组,未沉默的MDA-MB-231细胞作为空白组,分别注入30只裸鼠皮下,以后每周每组各处死10只裸鼠,取皮下肿瘤测量其体积并做石蜡切片,核增殖抗原Ki-67的免疫组织化学法检测皮下肿瘤癌细胞增殖情况。结果 RIP140在三阴乳腺癌组织中的表达明显高于非三阴乳腺癌组织,且均高于癌旁乳腺组织(P0.05)。RIP140强阳性患者的总生存率低于RIP140表达相对较低的患者(P0.05)。沉默MDA-MB-231细胞RIP140后,抑制三阴乳腺癌裸鼠皮下肿瘤的生长和增殖。结论 RIP140在三阴乳腺癌组织的高表达与三阴乳腺癌患者预后较差密切相关。沉默三阴乳腺癌细胞RIP140可抑制乳腺癌细胞的生长和增殖。下调三阴乳腺癌细胞RIP140的表达,可抑制三阴乳腺癌的发生和发展。     

沉默Medl9对人乳腺癌裸鼠成瘤的影响

目的:通过观察慢病毒介导的siRNA沉默Med19基因对人乳腺癌裸鼠成瘤的影响.探讨Med19在乳腺癌发生发展中的作用.方法:利用前期已稳定感染Med19-siRNA慢病毒载体的人乳腺癌MCF-7细胞.采用western blotting方法检测Med19蛋白的沉默效果.稳定感染Med19-siRNA慢病毒栽体的人乳腺癌MCF-7细胞接种于BALB/c裸鼠背侧皮下,观察裸鼠成瘤情况和移植瘤生长情况,并绘制生长曲线.以慢病毒空载体感染组作为阴性对照组.结果:所构建的Med19-siRNA慢病毒载体能有效抑制MCF-7细胞Med19蛋白的表达,蛋白表达水平下降了62%,Med19基因沉默组较空载体慢病毒感染组瘤体生长速度慢(t值分别为4.843、6.291、5-317,均p<0.01),肿瘤终体积分别为(620.08±263.07)mm3和(1 406.77±351.14)mill3,终重量分别为(0.20±0.18)g和(0.67±0.27)g,差异有统计学意义(t值分别为4.399、3.615,均P<0.01).结论:Med19基因沉默能有效抑制人乳腺癌裸鼠成瘤和移植瘤生长,表明 Med19在乳腺癌发生发展中起到重要作用,并有可能成为乳腺癌靶向治疗的潜在靶点.     

人骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达

背景人骨唾液蛋白基因在矿化组织以外的易发生骨转移的人乳腺癌中表达.临床观察显示骨转移处的乳腺癌细胞骨唾液蛋白的表达量要高于原发部位的乳腺癌细胞,因此骨唾液蛋白有可能与肿瘤特异性骨转移的关系密切.研究乳腺癌骨转移可为将来临床的预防和治疗提供新的药物靶点.目的建立骨唾液蛋白的稳定表达乳腺癌细胞系,观察骨唾液蛋白在乳腺癌骨转移的整个过程中的作用.设计对照实验.单位华南理工大学生物科学与工程学院,解放军广州军区广州总医院医学实验中心.材料实验于2003-11/2004-03在解放军广州军区广州总医院医学实验室完成.质粒、菌种和细胞pIRES2-EGFP载体质粒,E.Coli.Top10、含有人骨唾液蛋白基因全长的克隆载体pB-hBSP和发生特异性骨转移以及脑转移的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO和MDA-MB-231BR.方法将人骨唾液蛋白基因通过聚合酶链式反应的方法从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆出来,在其5'和3'端分别引入BglⅡ和Pst Ⅰ限制性酶切位点,定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP.利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性脑转移和骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BR和MDA-MB-231BO中.主要观察指标pIRES2-hBSP-EGFP重组表达载体的构建.重组表达载体pIRES2-hBSP-EGFP转染乳腺癌细胞.结果①成功构建人骨唾液蛋白和绿色荧光蛋白非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP.②成功转染特异骨转移和脑转移的乳腺癌细胞株,可在荧光显微镜下观察到荧光蛋白标记,人骨唾液蛋白得到相应表达.结论真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP的构建及转染可为骨唾液蛋白在乳腺癌骨转移中的作用的体内、外研究奠定一定的基础.     

小RNA干扰降低COX-2表达对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨小RNA干扰对MDA-MB-231乳腺癌细胞株COX-2蛋白表达及增殖凋亡的影响。方法:应用已合成的小RNA干扰质粒转染MDA-MB-231细胞株,采用免疫荧光技术和蛋白印迹法(Westernblotting)检测COX-2蛋白的表达;通过MTT实验和流式细胞术分别检测siRNA后对细胞增殖和凋亡的影响结果:转染后72 h,与阴性对照组细胞相比,实验组细胞的COX-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01);COX-2减低的乳腺癌细胞的增殖能力比对照组细胞明显受抑制(P<0.05);流式细胞仪检测实验组细胞与阴性对照组细胞相比早期凋亡增加(P<0.05)。结论:利用siRNA技术能够显著抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231中COX-2蛋白的表达;同时能够明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖,并可诱导其凋亡的发生。     

沉默环磷腺苷效应元件结合蛋白1对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的：探究环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein, CREB1）基因沉默对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法：针对人CREB1的基因序列设计并构建2条短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），采用慢病毒转染shRNA至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系抑制其CREB1的表达。将实验组分为shCREB1#1组和shCREB1#2组，同时将shSCR空载质粒转染至上述细胞系作为阴性对照组。采用实时定量PCR和Western-blot法检测转染效率；CCK-8法检测细胞的增殖能力；集落形成实验检测细胞的集落形成能力；流式细胞术检测细胞周期和凋亡率；细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力；Western-blot法检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白的表达。结果： 在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，相较于shSCR组，shCREB1#1和shCREB1#2组中CREB1基因的mRNA和蛋白表达水平均下降（P＜0.001）。沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移和侵袭能力减弱且细胞的凋亡率升高（P＜0.05）。此外，沉默CREB1可使细胞周期蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表达水平下调而促凋亡蛋白Caspase 3和Bax的表达水平上调。 结论：沉默CREB1可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力并诱导细胞凋亡。     

慢病毒介导的ROBO1沉默抑制乳腺癌细胞生长克隆及ATP合成

目的研究沉默ROBO1对乳腺癌细胞生长、克隆及三磷酸腺苷(ATP)合成的影响。方法乳腺癌细胞MDA-MB-231感染ROBO1 siRNA重组病毒和siRNA control重组病毒记为干扰组和阴性组,以不做处理的细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blot检测细胞中ROBO1 mRNA和蛋白水平,以MTT法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,荧光素酶法检测细胞合成的ATP水平,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测细胞中周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21蛋白水平。结果阴性组细胞中ROBO1 mRNA和蛋白水平、细胞OD值、克隆形成率、ATP水平、细胞周期比率及cyclin D1、p21蛋白水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。干扰组细胞中ROBO1mRNA和蛋白水平降低,细胞OD值也降低,克隆形成率及ATP水平下降,G_0/G_1期细胞比率升高,细胞中cyclin D1蛋白水平降低,p21蛋白水平升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论沉默ROBO1抑制乳腺癌细胞的生长、克隆及ATP合成能力,并且能将细胞周期阻滞在G_0/G_1期。     

CCN5基因敲降对MCF-7乳腺癌细胞增殖的影响及其作用机制

目的 探讨CCN5基因敲降对人乳腺癌细胞增殖的影响；探索CCN5在人乳腺癌细胞增殖中的作用机制；探寻CCN5与乳腺癌发生、发展中的相关性。方法 设置CCN5siRNA转染组，慢病毒空载体转染组，空白对照组，分别采用不同处理方法。CCN5siRNA转染组（以下简称“转染组”）：慢病毒载体介导的CCN5siRNA转染人乳腺癌细胞MCF-7；慢病毒空载体转染组（以下简称“空载组”）：慢病毒空载体转染人乳腺癌细胞MCF-7；空白对照组不进行任何转染操作。采用MTT法检测各组细胞的增殖能力变化，采用RT-PCR、Western blot检测各组细胞CCN5、Skp2和P27Kip1mRNA及蛋白表达。结果 MTT实验表明：转染组细胞增殖力高于空载组和空白对照组；RT-PCR和Western blot结果表明：转染组CCN5mRNA和蛋白水平低于空载组和空白对照组，差异有统计学意义（P <0.05）；转染组Skp2、P27Kip1mRNA和蛋白水平高于空载组和空白对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。结论 CCN5siRNA抑制CCN5mRNA和蛋白表达，促进乳腺癌细胞增殖，并且...     

survivin基因沉默对“三阴”乳腺癌细胞株中caspase3和caspase7基因的影响

目的 探讨“三阴”乳腺癌细胞中沉默survivin基因对抑癌基因caspase3和caspase7的影响.方法 针对survivin基因设计干扰片段并与真核表达载体pGCsilencerTMU6/Neo/GFP进行连接,之后转染“三阴”乳腺癌细胞MDA-MB-231;通过RT-PCR鉴定survivin基因mRNA水平沉默效果;用RT-PCR检测沉默survivin基因对caspase3和caspase7表达及细胞凋亡的影响.结果 survivin基因沉默可引起MDA-MB-231细胞凋亡;caspase3和caspase7表达升高,灰度分析结果显示差异具有统计学意义（P =0.008）.结论 （1）RNAi技术沉默MDA-MB-231细胞中survivin基因,达到了对其表达的抑制效果;（2）survivin基因沉默可上调caspase3和caspase7的表达;（3） survivin基因沉默可引起细胞凋亡;（4） survivin基因可作为“三阴”乳腺癌基因治疗的新靶点.     

siRNA沉默胰腺癌BXPC-3细胞中Her-2/neu基因对COX-2表达水平及细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响

目的分析胰腺癌BXPC-3细胞中原癌基因人表皮生长因子受体-2(Her-2/neu)基因siRNA沉默对环氧合酶-2(COX-2)表达水平及其对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法通过Western blot法与实时荧光定量PCR法对正常胰腺细胞株和胰腺癌BXPC-3细胞中的COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达进行检测。建立Her-2/neu基因siRNA慢病毒表达载体并对BXPC-3细胞进行转染,其中转染Her-2/neu siRNA慢病毒载体为观察组,转染NC-GFP-LV为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。分别采用CCK-8法、流式细胞分析仪和细胞实验技术(Transwell实验)分析Her-2/neu基因siRNA沉默对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。结果 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中的表达水平明显高于正常胰腺HPDE6C7细胞的表达(P0.01)。观察组COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达水平明显下调,较阴性对照组与空白对照组表达水平均明显降低(P0.01),而阴性对照组与空白对照组表达水平的比较,并无显著差异(P0.05)。Her-2/neu基因siRNA沉默可明显减弱细胞增殖和侵袭力,增加细胞凋亡率。结论 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中均呈现高表达,且Her-2/neu基因siRNA沉默可明显阻滞细胞增殖及侵袭,导致细胞凋亡。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

肇庆市居民颈椎病流行病学调查

目的 :调查肇庆市居民颈椎病发病情况及相关问题。方法 :通过分层随机抽样选择该市区18～70岁居民5000人为研究对象 ,入户或至单位询问调查。结果 :该市居民颈椎病发病率为8.11% ,男女差异无显著性 ,随着年龄的增长 ,发病率逐渐增加。经多因素分析 :体位姿势不正确、情绪紧张、潮湿、疲劳是发病的主要诱因。结论 :该病严重影响肇庆市居民的健康 ,做好防治应从早做起 ,综合防治。     

中国人四肢瘫日常生活能力评定量表的信度研究

目的研究四肢瘫日常生活能力评定量表评测四肢瘫患者的重测信度及观察者间信度。方法由1位评定者应用四肢瘫日常生活能力评定量表对20例四肢瘫患者进行评定,评定后1周内再次对该患者进行评定;另1位评定者在第1位评定者初次评定后2 d内对该患者进行评定。结果第1位评定者两次评定总分的组内相关系数为0.994(P<0.01);第1位评定者与第2位评定者评定总分的组内相关系数为0.971(P<0.01)。结论四肢瘫日常生活能力评定量表具有良好的重测信度及观察者间信度。     

心力衰竭病人延续性护理现状调查

[目的]了解心力衰竭病人延续性护理实施现状,探讨心力衰竭病人延续性护理方法及发展方向。[方法]用自行设计的调查问卷对114例心力衰竭病人的一般资料、自我护理状况及生活质量进行调查。[结果]不同文化程度、性别、职业、婚姻状态的病人生活质量得分不同,差异有统计学意义(P0.01),病人出院后的延续性护理以家人照顾为主,自我护理状况不理想。[结论]延续性护理模式在我国尚属初步实施阶段,临床医护工作者应积极倡导实施,鼓励家属参与及进行社区护理干预提高病人自我护理能力,提高生活质量。     

Evaluation of the aesthetics of physical methods of euthanasia of anesthetized rats

Dissection of living brain tissue for in vitro experiments requires the use of a rapid euthanasia method. However, the method must not subject animals to unnecessary pain and must be aesthetically acceptable to experimenters. The purposes of the current study were to assess the aesthetics of 6 euthanasia methods, measure the procedure duration, and evaluate brain for pathology after each procedure. We digitally recorded euthanasia of isoflurane-anesthetized rats by 6 physical methods: anesthetic overdose, cardiac exsanguination, decapitation, closed intrathoracic transection of the great vessels and heart, thoracic percussion, and thoracotomy with rupture of great vessels. Volunteer researchers and animal caretakers watched the video and completed an associated questionnaire. Anesthetic overdose and cardiac exsanguinations were rated most aesthetically pleasing, although these procedures took the longest to complete. In contrast, decapitation and thoracic percussion were the least aesthetically pleasing, but these methods were the quickest. No demographic factor was identified that could predict whether a given euthanasia procedure would be favored for aesthetic reasons, and participants provided a wide variety of rationales for the aesthetic ratings they assigned. Although all of these euthanasia methods meet the criteria of approved methods of euthanasia of anesthetized rats as defined by the AVMA, aesthetic features and the scientific need for rapid euthanasia are both considerations in selecting a method.