运用半导体测序法检测4种遗传病常见突变

目的 运用基于半导体芯片技术的下一代测序方法对地中海贫血、遗传性耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关的38个常见致病突变位点进行基因测序,探讨半导体测序技术在遗传病检测方面的应用价值. 方法 采用AmpliSeq方法通过多重PCR捕获目的片段,然后构建文库,用Ion Torrent ProtonTM测序仪进行测序反应,进而通过Sanger一代测序法进行结果比较验证. 结果 33个样本中共检测出15例样本存在功能性遗传变异,其中HBB:52A＞T 5例、HBB:84_85insC 3例、HBB:45_46insG 2例、HBB:2T＞G 1例、GJB3:538C＞T 1例、ATP7B:2333G＞T 1例、GJB2:235delC 1例、SLC26A4:IVS7-2A＞G 1例,Sanger一代测序结果与下一代测序结果完全一致. 结论 半导体测序能准确检测该4种遗传病常见突变,对遗传病发病机制的研究及筛查具有一定的应用价值.     

威海市新生儿苯丙酮尿症筛查结果分析

目的了解威海市新生儿苯丙酮尿症发病率及其诊治情况。方法采用Guthrie’s细菌抑制法(BIA)测定新生儿滤纸干血片中的苯丙氨酸(Phe)含量,筛查切值为120umol/L。对血Phe浓度高于切值者,实施BH4负荷试验或Phe BH4联合负荷试验及尿蝶呤谱分析,进行鉴别诊断。结果威海市新生儿苯丙酮尿症发病率为1/9639:经典型PKU经低Phe饮食治疗后,其体格和智能发育良好,智商(IQ)>85,BH4D经BH4和左旋多巴(L-DOPA),5-羟色氨酸(5-HTP)联合治疗,临床症状明显缓解。结论威海市新生儿PKU发病率,略高于全国的平均水平,符合全国发病率北高南低的特点。对初筛为可疑阳性新生儿尽早实施鉴别诊断试验,有助于恰当治疗措施的选择,改善预后。     

应用荧光法筛查吉林地区新生儿苯丙酮尿症

目的了解吉林地区新生儿苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）的发病情况。方法本地区出生的新生儿27509例,取出生48～72h充分哺乳后的足跟血滤纸片标本,以荧光法测定新生儿滤纸干血斑苯丙氨酸（Phe）含量,凡苯丙氨酸≥120μmol／L者为实验阳性,则召回婴儿取第二张血纸片标本进行复查。结果27509例标本中,初次筛查检出7例阳性结果,其浓度在121～1740μmol／L之间,7例已复查,3例结果仍为阳性,其余均正常,吉林地区苯丙酮尿症发生率为1／917。结论吉林地区苯丙酮尿症发生率为1／917。     

山东省30例苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因的突变分析

目的 研究山东省30例苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因的突变特点。方法 使用二代测序技术结合生物信息学分析手段检测PAH缺乏型苯丙酮尿症患者PAH基因的变异位点。结果 30例患者的60个PAH等位基因中共检测出53个PAH基因位点突变,检出率为88.3%。检测出的27种PAH基因的突变类型包括17种错义突变、4种无义突变、4种剪接突变、1种同义突变和1种移码突变。突变分布在第1-3、5-7、10-12号外显子和第4号、5号、7号、12号内含子上。其中热点突变为c.728G>A(24.53%)、c.721C>T(7.55%)和c.1238G>C(5.66%),新突变位点为：c.155T>G和c.621T>A。结论 山东省30例PKU患儿的PAH基因突变以错义突变为主,主要发生在第7号外显子上。研究检测出PAH基因的27个突变位点,包括2个新的突变位点,为苯丙酮尿症的产前诊断和机制研究提供依据。     

苯丙酮尿症基因纯合子突变6例

目的:报道6例苯丙酮尿症(PKU)基因纯合子突变分析结果.方法:采用聚合酶链式反应结合基因序列测定技术.结果:在新疆的汉族、维吾尔族和回族三个民族中,检出了6例5种PKU基因的纯合子突变,即R243Q(2例)、R176X、R111X、P281L和IVS4-1G→A,这5种PKU基因突变均为新疆地区常见或较常见的突变类型.结论:新疆的PKU基因突变具有较强的民族特性,表现出极大的遗传异质性.研究结果将为该地区有针对性的PKU防治战略提供科学依据,也是对我国民族和地区资料的重要补充.     

PHE/TYR比值在新生儿苯丙酮尿症筛查中的应用

目的 分析Phe/Tyr比值在新生儿苯丙酮尿症筛查中的作用.方法 采用API-300 SPOTCHECK连续流动荧光分析系统检测1103例正常新生儿的筛查血片和27例已经确诊的PKU阳性患儿血片的Phe和Tyr值,并进行分析.结果 API-300 SPOTCHECK连续流动荧光分析法的阳性复合率为103.7%,阴性复合率为99.9%.结论 Phe/Tyr 比值是提高PKU筛查准确度的重要参数.     

新生儿苯丙酮尿症的筛查与防治概况

苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU)是一种遗传代谢病,是由于体内苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)活性降低或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)缺乏,导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻,血液和组织中苯丙氨酸浓度增高,致使尿中苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸亦显著增加。高浓度的苯丙氨酸和低浓度的酪氨酸可损害神经系统,影响脑部发育,最终导致患儿智力低下和体格生长发育迟缓。本病发病率具有种族和地域差异,我国PKU的患病率约为     

徐州市新生儿苯丙酮尿症筛查结果分析

目的通过对苯丙酮尿症(PKU)的筛查,了解徐州市遗传性代谢病苯丙酮尿症的发病情况及临床类型。方法取出生72h后并喂足高蛋白奶6次以上的新生儿足跟末梢血,应用荧光定量法测定血苯丙氨酸(phe)水平。且对2003年1月至2010年9月徐州市新生儿疾病筛查资料进行回顾分析。结果 6年间徐州市活产969 144例,筛查762 141例,总筛查率为78.6%;筛出可疑苯丙酮尿症556例,复诊533例,复诊率为95.9%;确诊96例,其中经典型PKU 39例,中度PKU 36例,轻度高苯丙氨酸血症17例,四氢生物喋呤(BH4)缺乏症4例。PKU发病率为1∶7938;治疗率为95.83%。结论徐州市6年PKU筛查率及可疑患者复诊率逐年提高;PKU发病率和治疗率高于全国平均水平。     

细菌抑制法筛查新生儿苯丙酮尿症标准曲线拟合公式的选择

采用细菌抑制法筛查新生儿苯丙酮尿症，对试剂盒所提供标准品(Y)和相应细菌环直径(X)经过微机处理，比较了7种不同拟合方式其曲线拟合的准确性，利用各回归方程计算结果与理论值的相符程度，结果表明：应用lgY=a blgX方程计算较为合适。     

2021年郑州市新生儿苯丙酮尿症筛查情况分析

目的 分析2021年郑州市新生儿苯丙酮尿症(PKU)的筛查情况。方法 选取2021年1月至2021年12月郑州市各新生儿疾病筛查中心辖区出生的活产新生儿100 971例为筛查对象,采集符合标准的血样,送至新生儿疾病筛查中心进行统一检测,采用化学荧光法检测滤纸干血斑上苯丙氨酸浓度,筛选出阳性患儿,并召回复诊,对确诊结果进行分析。结果 郑州市2021年新生儿PKU筛查总数为100 971例,初筛阳性病例178例,均全部召回,确诊阳性14例,发病率为1/7 212;2021年1月至2021年12月郑州市新生儿初筛阳性发生率3月份最高,确诊阳性发生率11月份最高。结论 郑州市2021年新生儿仍存在一定的PKU发生风险,后续还应加强管理和健康宣传,做到早筛查、早诊断、早治疗。     

下一代测序技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用

以下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)为代表的基因组学技术的迅猛发展给全面深度的染色体筛查和基因诊断提供了机会.NGS也迅速应用于胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)和胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)临床检测中,成为常规检测技术,经济与可靠使其具有更广阔的应用前景.单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术的进步使得NGS在PGD和PGS的临床应用中能够更加全面了解植入前胚胎的遗传学信息,可以检测到更加细微的差异;基于NGS技术的PGS和PGD将给移植成功率和试管婴儿(in-vitro fertilization,IVF)出生率带来明显提升.本文主要介绍PGD/PGS的定义、传统的PGD/PGS检测技术,单细胞全基因组扩增技术以及NGS在PGD/PGS中的应用.     

二代测序技术在儿童T淋巴母细胞淋巴瘤全外显子测序中的应用

目的建立从石蜡包埋的儿童T淋巴母细胞淋巴瘤（T-LBL）病理组织中提取基因组DNA,采用二代测序技术行全外显子测序检测的方法并分析其可行性。方法从10例儿童T-LBL石蜡包埋组织中提取基因组DNA,PCR反应扩增后采用二代测序技术行全外显子测序检测并确定致病位点,所获得的致病突变采用Sanger测序法测序确认,比较两种方法的一致性。结果10例石蜡包埋T-LBL组织标本中均成功提取到基因组DNA,采用二代测序技术开展全外显子测序测序均检测到致病突变;二代测序检测结果经Sanger测序法验证,证实致病突变确实存在,且与Sanger测序结果一致。结论基于二代测序技术的全外显子测序测序可用于检测石蜡包埋的儿童T-LBL病理标本的致病突变。     

应用下一代测序技术对α地中海贫血进行胚胎植入前遗传学检测

目的 探讨下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术在α地中海贫血胚胎植入前遗传学检测中的应用. 方法 选取2对α地中海贫血--SEA缺失型携带者夫妇体外受精胚胎活检后的6个胚胎样本应用全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术、下一代测序技术进行胚胎植入前遗传学检测,同时采用跨越断裂点荧光PCR(gap-PCR)进行平行对照检测. 结果 2个家系6个胚胎样本的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)结果分别为--SEA/αα母源携带、--SEA/--SEA、--SEA/αα母源携带、--SEA/--SEA、--SEA/αα母源携带和--SEA/--SEA;胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)结果分别为45,XX,-5、46,XX、46,XY、47,XY,+1、46,XX和46,XY,+1,-2;Family 1 gap-PCR检测结果为父母均为SEA杂合子;E1为正常、E2为SEA纯合子、E3为正常;Family 2检测结果分别为:父母均为SEA杂合子;E4为SEA纯合子、E5为正常、E6为SEA纯合子. 结论 结果显示利用NGS不仅可以检测出23对染色体的核型,同时解决了单细胞扩增等位基因脱扣(allele drop-out,ADO)造成的假阳性和假阴性的风险,更具有市场潜力及应用前景.     

基于下一代测序平台的结直肠癌KRAS基因检测

目的 基于下一代测序技术,检测和分析结直肠癌KRAS基因的突变情况,以及评估其应用于临床分子诊断中的可行性.方法 应用Ion Proton半导体测序仪,检测108例结直肠癌患者的石蜡包埋组织样本的KRAS基因突变情况,并与作为金标准的一代测序检测结果进行对比.结果 下一代测序检测结果与一代测序检测结果基本一致,符合率为94％,灵敏度高达100％.结论 通过对108例临床样本的检测分析后,该下一代测序检测方法可用于检测结直肠癌KRAS基因突变情况.     

Technical progress in circulating tumor DNA analysis using next generation sequencing

Circulating tumor DNA (ctDNA) is tumor-derived, fragmented DNA that circulates freely in body fluids, predominantly in the peripheral blood. Recently, ctDNA analysis has been suggested as a complement to tissue biopsy in the detection and treatment of cancer. Genetic and epigenetic information specific to tumor cells, including single nucleotide variations, copy number variations, and modified methylation patterns, can be detected in ctDNA. Importantly, mutations in heterogenous tumors that could impart therapeutic resistance could be identified in ctDNA, which would aid in cancer diagnosis, prognosis, and real-time monitoring, and inform treatment with targeted therapies. However, ctDNA is still not a routinely used method for this purpose, because its detection techniques lack adequate sensitivity for reliable use in scientific studies and clinical trials. This review provides an up-to-date summary of ctDNA mutation detection methods based on next generation sequencing, highlighting their advantages and limitations, and focusing in particular on several optimized library preparation methods for improved sensitivity and specificity of ctDNA detection.     

Keeping up with the next generation: massively parallel sequencing in clinical diagnostics

The speed, accuracy, efficiency, and cost-effectiveness of DNA sequencing have been improving continuously since the initial derivation of the technique in the mid-1970s. With the advent of massively parallel sequencing technologies, DNA sequencing costs have been dramatically reduced. No longer is it unthinkable to sequence hundreds or even thousands of genes in a single individual with a suspected genetic disease or complex disease predisposition. Along with the benefits offered by these technologies come a number of challenges that must be addressed before wide-scale sequencing becomes accepted medical practice. Molecular diagnosticians will need to become comfortable with, and gain confidence in, these new platforms, which are based on radically different technologies compared to the standard DNA sequencers in routine use today. Experience will determine whether these instruments are best applied to sequencing versus resequencing. Perhaps most importantly, along with increasing read lengths inevitably comes increased ascertainment of novel sequence variants of uncertain clinical significance, the postanalytical aspects of which could bog down the entire field. But despite these obstacles, and as a direct result of the promises these sequencing advances present, it will likely not be long before next-generation sequencing begins to make an impact in molecular medicine. In this review, technical issues are discussed, in addition to the practical considerations that will need to be addressed as advances push toward personal genome sequencing.     

下一代测序技术在遗传病临床检测中的应用

DNA测序技术已广泛应用于生物学研究,很多生物学问题也都可以借助测序技术予以解决.过去10年(2005-2015年),下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)逐步从新技术成长为主流的测序技术,并逐渐走进临床诊断领域.NGS以其简单、快速、高分辨率、高通量的特点,在传染性疾病防控、肿瘤的早诊早治、遗传病的早期筛查和诊断、无创产前筛查、胚胎植入前诊断和筛查等领域发挥越来愈大的作用,已成为目前临床领域最具有应用前景的技术之一.同时下一代测序技术领域仍在快速发展,新的测序技术及数据分析技术还在不断涌现,序列数据库和测序数据快速增加.下一代测序技术也有助于以更低廉的价格,更全面、更深入地来分析基因组、转录组及蛋白质相互作用组的各项数据.可以预见,各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段,有望给生物医学研究领域和医学临床诊断带来革命性的变革.本文主要针对下一代测序技术在无创产前诊断、遗传病检测、胚胎植人前诊断和筛查中的临床应用进行介绍和评述.     

微阵列比较基因组杂交技术与二代基因测序检测拷贝数变异的对比

目的 对比分析微阵列比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)和第二代基因测序技术(next generation sequencing,NGS)在基因组拷贝数变异(copy number variation,CNV)上的一致性,为临床检测CNV提供新的检测方法. 方法 提取15例流产组织临床样本的基因组DNA,然后分别使用aCGH和NGS 2种方法对上述DNA进行检测,分析对比每个样本的CNV的数目. 结果 aCGH共检测到CNV数有109个,最小的片段有16 kb,最大的片段有34Mb,其中小于200 kb的有20个,大于200 kb小于1 Mb的有34个,大于1 Mb小于5 Mb的有26个,大于5 Mb小于34Mb的有29个.NGS共检出68个CNV,其中小于200 kb的有3个,检出率为15.0％;大于200 kb小于1 Mb的有22个,检出率为64.7％;大于1 Mb小于5 Mb的有20个,检出率为76.9％;大于5 Mb小于34 Mb的有29个,检出率为100.0％. 结论 对于目前的数据量来说,NGS在检测大于5Mb的大片段CNV上检出率较高,与aCGH具有一定的一致性,可以应用于流产组织中CNV的检测.对于小片段的CNV的检测,需要增加相应的读取的数据量进行检测.