心血管疾病的一类新药:Na+/H+交换体抑制药

Na+-H+交换体(Na+/H+exchanger,NHE)是一种重要的交换系统,在正常生理状态下参与胞液pH和细胞容量调节.分子克隆技术已发现6个NHE的异构体(分别为NHE-1至NHE-6),NHE-1在所有体细胞上普通表达[1];在心肌细胞里,NHE-1主要在连结蛋白43近端的插入盘和T管上表达;NHE-1又是唯一在心肌细胞原生质膜上表达的异构体.业已证实,几种心血管疾病的病理生理都涉及到它[1].     

隐丹参酮对肺癌细胞铁死亡相关基因表达的影响

目的考察隐丹参酮(cryptotanshinone,CTS)对肺癌细胞及其顺铂耐药肺癌细胞存活率及铁死亡相关基因表达水平的影响,并探讨其相关机制。方法体外培养人肺癌A549细胞和顺铂耐药A549/DDP细胞,给予不同浓度CTS处理。CCK-8法检测细胞存活率;qPCR检测与铁代谢相关的TFR1、DMT1、IREB2、HSPB1、VDAC2、VDAC3、GPX4的mRNA表达水平;Western blot检测TFR1蛋白表达水平。结果不同浓度的CTS可抑制A549细胞和A549/DDP细胞的增殖,且顺铂耐药A549/DDP细胞对CTS的作用更敏感。CTS作用于A549细胞和A549/DDP细胞后,对铁死亡相关基因的mRNA表达水平呈现不同程度的影响,A549细胞HSPB1和GPX4的mRNA表达水平增高,IREB2、VDAC2和VDAC3的mRNA表达水平降低, TFR1和DMT1的mRNA表达水平变化不明显;A549/DDP细胞TFR1和IREB2的mRNA表达水平增高,VDAC3的mRNA表达水平降低,DMT1、HSPB1、VDAC2和GPX4的mRNA表达水平变化不明显。结论隐丹参酮能不同程度的抑制肺癌A549细胞和A549/DDP细胞的增殖,及影响细胞铁死亡相关基因的表达。     

丹皮酚抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑组织细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的表达

目的观察丹皮酚对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响,以探讨其脑保护的作用机制。方法线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,大鼠脑缺血2 h再灌注24 h,采用Western blot及RT-PCR法观察大鼠脑组织ICAM-1、VCAM-1的蛋白及mRNA表达。结果丹皮酚明显降低缺血区脑组织ICAM-1、VCAM-1的蛋白及mRNA的表达。结论丹皮酚可能通过降低缺血区脑组织黏附分子表达发挥脑保护作用。     

靶向调控AQP4对非小细胞肺癌细胞化疗敏感性的调控作用

摘要：目的 探讨靶向沉默水通道蛋白4（AQP4）基因对非小细胞肺癌细胞化疗敏感性影响,并研究其分子作用 机制。方法 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）和 Western blot 分别检测非小细胞肺癌 A549 细胞以及顺铂耐药菌株 A549/DDP中AQP4 mRNA和蛋白的表达。设计靶向AQP4的siRNA-1和siRNA-2,采用siRNA抑制A549/DDP细胞 中AQP4的表达,筛选出最优siRNA,将其转染A549/DDP细胞,设立siRNA-NC组和空白对照组。CCK-8法检测细胞 增殖能力并计算各组细胞的半数抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测细胞凋亡。Western blot检测P53和Bcl-2蛋白的 表达。结果 AQP4 mRNA和蛋白在A549/DDP细胞中的表达水平显著高于A549细胞,AQP4表达沉默后A549/DDP 细胞增殖抑制,细胞凋亡增加,对顺铂的敏感性增加,凋亡相关蛋白P53表达增加,而Bcl-2蛋白表达降低。结论 通 过靶向调控AQP4的表达可以增加非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性。     

志苓胶囊对小细胞肺癌细胞株NCI-H446细胞凋亡及h-TERT、CD44表达的影响

目的研究志苓胶囊(抗癌复方Ⅱ号)对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446诱导凋亡作用机制以及对细胞黏附分子表达的影响。方法将志苓胶囊按其不同的中西药成份配制成相应的中药组、西药组和复方组,与NCI-H446共培养后,倒置显微镜观察、Hochest33258荧光染色法检测凋亡细胞,RT-PCR、Western blot、流式细胞仪分别检测bcl-2、bax、hTERT基因mRNA和相应蛋白表达水平变化以及黏附分子CD44的表达变化。结果NCI-H446经不同的药物组处理后,倒置显微镜、Hochest33258荧光染色可观察到细胞凋亡形态学改变,bcl-2基因mRNA和蛋白表达水平均有不同程度下降,bax基因表达水平则有不同程度增强,复方组改变最明显,各药物组与对照组比较差异具有显著性(P<0.01)。中药组和西药组hTERT基因和蛋白表达水平未见明显改变,复方组表达水平下调,与对照组比较差异具有显著性(P<0.01)。各药物组CD44表达水平降低,其中复方组降低水平最明显(P<0.01)。结论志苓胶囊可能通过下调NCI-H446细胞bcl-2、hTERT基因和CD44分子表达,增强bax基因表达,从而诱导NCI-H446细胞凋亡,抑制细胞黏附、转移。     

人参皂苷Rh1 诱导Hela 和K562 细胞凋亡

目的研究人参皂苷Rh1诱导宫颈癌Hela细胞系和白血病K562细胞系的细胞凋亡作用及其机制。方法体外培养Hela细胞和K562细胞,并用Rh1的浓度梯度和时间梯度处理细胞;流式细胞术检测细胞凋亡率;荧光定量PCR检测Bcl-2和Bax基因mRNA表达区别。结果 Rh1以浓度依赖方式诱导Hela细胞核K562细胞凋亡。Bcl-2基因mRNA的表达均出现明显下降,而bax基因,mRNA表达水平均明显上升。结论 Rh1诱导Hela细胞和K562细胞凋亡。Bcl-2表达下降和Bax表达上升是其诱导细胞凋亡的重要机制之一。     

锰超氧化物岐化酶模拟化合物诱导K562细胞凋亡的机制研究

目的观察锰超氧化物岐化酶模拟化合物(mimics of manganese superoxide dismutase,MnSODm)对人白血病K562细胞凋亡诱导作用,并探讨其分子机制。方法以人白血病K562细胞为靶细胞,四氮唑蓝比色法(MTT法)测定细胞增殖活性;Annexin V/PI双标记和细胞形态学法检测细胞凋亡;RT-PCR检测bcl-2和bax基因mRNA的表达水平;流式细胞术(FCM)测定Bcl-2和Bax蛋白表达水平、线粒体跨膜电位(Δψm)、细胞色素C(Cyt C)释放和Caspase-3活性变化。结果0.5~10mg·mL-1MnSODm明显抑制K562细胞增殖(P<0.01),Annexin V/PI染色显示凋亡细胞明显增多,光学显微镜和透射电镜观察呈现典型的凋亡形态改变;bcl-2基因mRNA和蛋白表达下调,bax基因mRNA和蛋白表达上调,线粒体Δψm降低,Cyt C释放增多,Caspase-3活性增强。结论MnSODm调控Bax/Bcl-2表达,通过线粒体途径诱导K562细胞凋亡。     

藤茶双氢杨梅树皮素诱导人肺癌A549细胞凋亡及其机制研究

目的：探讨藤茶双氢杨梅树皮素（ampelopsin,APS）抗人肺癌A549细胞的作用。方法：以MTT法和集落形成法观察APS对人肺癌A549细胞的体外抑制作用;采用RT-PCR技术测定APS对人肺癌细胞株A549抑瘤基因p53表达的影响。结果：APS能明显抑制体外培养的A549细胞的生长,MTT法中IC50为9.8μg·mL^-1;细胞生长曲线法提示其对A549细胞的生长也有明显的抑制作用;集落形成试验中,当药物浓度为14.84,9.90,6.60,4.40μg·mL^-1时,抑制率分别为100%,91.6%,64.5%和23.4%;当浓度为25μg·mL^-1时,APS能显著增强p53基因的表达水平。结论：APS对体外培养的人肺癌A549细胞的生长有明显的抑制作用,对抑癌基因p53表达的影响是其抗肿瘤的作用机制之一。     

二氯乙酸对人尿路上皮细胞膀胱癌相关基因甲基化、转录和蛋白表达的影响

目的探讨二氯乙酸对人尿路上皮SV-HUC-1细胞膀胱癌相关癌基因c-myc和抑癌基因APC、SFRP1、SFRP5甲基化、转录水平以及蛋白表达量的影响,为阐明其毒性机制提供科学依据。方法采用CCK-8法检测二氯乙酸对SV-HUC-1细胞的细胞毒性,确定不显著影响细胞存活率的浓度及处理时间。以1和2 mmol/L浓度二氯乙酸分别对SV-HUC-1细胞染毒24、48和72 h,采用甲基化特异性PCR(MSP)和real-time PCR对细胞中c-myc、APC、SFRP1和SFRP5基因的甲基化状态和mRNA表达量进行检测。以2 mmol/L浓度二氯乙酸对SV-HUC-1细胞染毒72 h,采用Western blot对c-myc蛋白进行蛋白表达量检测。结果二氯乙酸可使SV-HUC-1细胞中c-myc基因非甲基化程度升高,mRNA和蛋白表达量上升;可使APC、SFRP1和SFRP5基因甲基化程度升高,mRNA表达量下降。结论二氯乙酸可影响SV-HUC-1细胞癌基因c-myc和抑癌基因APC、SFRP1、SFRP5的甲基化和表达,提示其可能有一定的表观遗传毒性。     

镉恶化转化16HBE细胞中核苷酸切除修复基因的表达

目的 探讨氯化镉恶性转化人支气管上皮(16HBE)细胞过程中核苷酸切除修复基因ERCC1和ERCC2基因的mRNA和蛋白动态变化规律.方法 用反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学(SP法)检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞不同阶段(第5、15、35代细胞及成瘤细胞)ERCC1和ERCC2基因的mRNA和蛋白的表达情况.结果 随着转化代数的增加,ERCC1基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低,到第35代细胞后表达明显下降(P＜0.01);而ERCC2基因的mRNA和蛋白表达水平在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中差异无统计学意义(P＞0.05).结论 镉化物的致癌机制可能与ERCC1基因表达水平下调有关.     

人肺癌组织多药耐药基因的探讨

本文采用RT-PCR方法检测了38例NSCLC肿瘤组织,10例良性瘤样病变争35例病灶旁正常肺组织中mdrl基因的表达水平。结果表明,肺癌组织中mdrl mRNA过度表达,因此推测mdrl基因表达是肺癌产生耐药性的主要机制之一。     

表达反义蛋白激酶Ca提高人肺癌LTEPa—2细胞对抗肿瘤药物的敏感性

AIM: To study the role of protein kinase C alpha (PKC alpha) in sensitivity to some clinical anticancer drugs in human lung cancer LTEPa-2 cells. METHODS: Human lung cancer cell model expressing antisense PKC alpha was established and characterized by gene transfection and immunoblotting. Northern blotting was used to analyze the expression of multiple drug resistance (mdr-1) gene and antisense PKC alpha mRNA. IC50 for some anticancer drugs in cultured cells were measured. RESULTS: Expression of antisense PKC alpha mRNA inhibited mdr-1 gene expression in lung cancer cells and improved sensitivity to anticancer drugs (harringtonine, carboplatin, bleomycin A5, vincristine and doxorubicin) in lung cancer cells. IC50 for harringtonine, carboplatin, bleomycin A5, vincristine, and doxorubicin was decreased by 46.4%, 42.1%, 79%, 69.9%, and 61.6% respectively. CONCLUSION: PKC alpha plays an important regulation role of mdr-1 gene expression and drug sensitivity in human lung cancer cells.     

FEN1在食管癌中表达研究

目的:研究FEN1基因在人食管癌中的mRNA和蛋白表达及其与肿瘤发生的关系。方法:采用SYBRGreen实时定量PCR技术检测32例食管癌组织及癌旁组织中的FEN1基因的mRNA水平;同时采用免疫组化技术检测上述32例组织中FEN1的蛋白水平及分布。结果:与癌旁组织相比,FEN1基因在食管癌组织中mRNA水平较癌旁组织显著上调,约为癌旁组织的3.46倍。免疫组化的结果也表明FEN1基因在食管癌组织中表达要高于癌旁组织。结论:FEN1基因在人食管癌中较癌旁组织表达显著上调。FEN1基因的表达与食管癌的发生密切相关。     

Survivin基因在大肠癌中的表达及与端粒酶活性的关系

目的：探讨survivin基因在大肠癌中的表达及与端粒酶活性的关系。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和端区重复扩增法酶联免疫吸附测定(TRAP—ELISA)方法检测大肠癌及其癌旁组织survivin mR—NA表达和端粒酶活性情况。结果：(1)65％大肠癌组织表达survivin mRNA，而癌旁组织25％表达。Survivin基因表达与肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移及分化程度无明显关系。(2)大肠癌组织端粒酶活性阳性率为90％，明显高于癌旁组织的5％，端粒酶表达阳性与大肠癌淋巴结转移、分化不良程度显著相关。(3)Survivin mRNA表达与端粒酶活性明显相关。结论：Survivin基因在大肠癌发生发展中可能起作用。端粒酶可作为诊断大肠癌的标志物。Survivin表达上调和端粒酶激活可能通过各自不同的信号途径在大肠癌变中发挥协同作用。     

5-氮-2’脱氧胞苷诱导肺癌细胞系CDH13基因去甲基化及其表达

目的 观察去甲基化制剂5-氮-2’脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)对人肺癌细胞系A549和LTEP-a2中CDH13基因启动子区甲基化状态及表达的影响,探讨肺癌细胞CDH13基因失活的机制及去甲基化制剂对CDH13基因表达的调控作用. 方法 5-Aza-dC处理体外培养的肺癌细胞A549、LTEP-a2及正常肺细胞系HFL1后,用甲基化特异性 PCR( MSP) 法检测处理前后细胞中CDH13基因的甲基化状态,半定量逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)法检测用药前后细胞中CDH13 mRNA表达的变化. 结果 正常肺细胞中未见CDH13启动子甲基化,肺癌细胞A549、LTEP a2均发现CDH13启动子甲基化现象;应用 5-Aza-dC能使 CDH13基因启动子区 CpG 岛发生去甲基化. 肺癌细胞A549、LTEP-a2均可见CDH13 mRNA表达,但与正常肺细胞比较表达较弱,经药物处理癌细胞后其CDH13 mRNA的表达较前明显增强. 结论 启动子区异常甲基化是肺癌细胞CDH13基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-dC能完全逆转CDH13基因甲基化状态,从而调控CDH13基因表达.     

Expression and DNA methylation status of the Rap2B gene in human bronchial epithelial cells treated by cigarette smoke condensate

Abstract

Background: The relationship between lung cancer and smoking has been demonstrated. The Rap2B gene is usually overexpressed in lung cancers. This study was aimed to investigate the Rap2B gene expression and its promoter methylation in human bronchial epithelial cells (16HBE) treated by cigarette smoke condensate (CSC).

Methods: 16HBE cells were treated with CSC (1/8 IC₅₀). Soft ager assay, tumorigenicity test, chromosome aberrations analysis were used to identify the transformed cells. The expression level of mRNA and protein of Rap2B was detected using real time PCR and Western blotting, respectively. The genome DNA methylation level was detected using combined bisulfite restriction analysis (COBRA) and the methylation status of the target fragment in Rap2B gene promoter was determined by bisulfite sequencing PCR (BSP).

Results: The 16HBE cells were successfully malignant transformed after the chronic exposure to CSC. The expression of Rap2B gradually increased in the process of malignant transformation. Meanwhile, global DNA was hypomethylated. However, no obvious change was observed in the methylation level of Rap2B gene promoter in transformed 16HBE cells.

Conclusions: Rap2B gene may play an important role in the process of lung cancer and global DNA hypomethylation might be an early event in tumorigenesis.     

鸟氨酸脱羧酶基因表达与肺癌相关性的体外研究

目的研究鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因在肺癌中的表达,探讨其在肺癌形成中的作用。方法用RT-PCR和Western Blot的方法,分别从mRNA和蛋白质水平测定84例肺癌标本的癌旁正常组织和癌组织中的ODCmRNA表达的相对水平,观察其与临床病理学指标的关系;并通过已构建和包装的ODC反义表达载体pcDNA-ODCr,体外研究ODC基因反义RNA对肺癌细胞生长抑制作用。结果RT-PCR显示84例肺癌组织中ODC基因表达较癌旁正常组织高(P<0.01),ODC基因表达在不同病理类型、不同分化程度之间无显著性差异(P>0.05),在临床分期之间有显著性差异(P<0.01),在晚期肺癌组织中比早期组织中明显增强(P<0.01);Western Blot结果显示肺癌组织中ODC的表达明显高于癌旁正常肺组织;体外研究表明ODC的反义RNA表达载体转染组细胞的增殖明显比对照组细胞和空载体转染组细胞缓慢。结论ODC在肺癌组织中表达增高,并与恶性程度呈正相关,提示ODC表达增强可能与肺癌的发生、浸润有关,为肺癌的病因研究及诊断治疗提供了实验依据。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷诱导卵巢癌细胞系p16基因去甲基化及其表达

目的观察去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对体外培养的卵巢癌细胞CAOV3p16基因启动子区甲基化状态及表达的影响,探讨卵巢癌细胞p16基因失活的机制及去甲基化制剂对p16基因表达的调控。方法应用不同浓度的5-Aza-CdR(1×10-7mol/L,5×10-7mol/L,1×10-6mol/L,5×10-6mol/L)处理体外培养的卵巢癌细胞CAOV3后,甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)(MSP)法检测用药前后细胞中p16基因的甲基化状态,RT-PCR法及Western-blot法检测用药前后细胞中p16 mRNA及蛋白表达的变化。结果p16基因在卵巢癌细胞系CAOV3中启动子区呈异常甲基化状态,在 mRNA及蛋白水平低表达。经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,其 mRNA及蛋白表达显著增强(P<0.01)。结论启动子区异常甲基化是卵巢癌细胞p16基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂-5-Aza-CdR能逆转p16基因甲基化状态,从而调控p16基因表达。     

乳腺癌石蜡肿瘤组织和相应血液细胞BRCA1、ERCC1、TSmRNA的表达相关性研究

目的 探讨乳腺癌石蜡肿瘤组织和相应血液细胞中乳腺癌易感基因1（BRCA1）与切除修复交叉互补基因1（ERCC1）及胸苷酸合成酶（TS）基因表达的相关性,同时探讨BRCA1、ERCC1、TS在乳腺癌肿瘤组织与对应患者血液细胞中表达的关系。方法 收集53例乳腺癌肿瘤石蜡标本及其对应的血液样本,利用实时荧光定量PCR技术检测肿瘤石蜡组织和对应血液样本中BRCA1、ERCC1、TS mRNA的表达水平;利用Pearson相关性分析方法分析肿瘤石蜡组织和相应血液细胞BRCA1、ERCC1、TS mRNA表达的相关性以及肿瘤石蜡组织细胞BRCA1、ERCC1、TS mRNA之间表达的相关性。结果 乳腺癌石蜡组织中BRCA1 mRNA表达的ΔCT为（7.516±2.257）,对应的血液组织中为（10.374±2.519）。乳腺癌石蜡组织中ERCC1和TS mRNA表达的ΔCT分别为（6.114±2.944）、（5.950±2.604）,对应的血液组织分别为（8.801±2.581）、（10.078±1.731）。Pearson相关性分析显示,BRCA1、ERCC1在肿瘤石蜡组织与血液组织中的表达均呈正相关（r=0.607、0.537,P〈0.05）。肿瘤石蜡组织与血液组织中的TS表达无相关性（r=0.074,P〉0.05）。BRCA1与ERCC1在肿瘤石蜡组织中的表达无相关性（r=0.250,P〉0.05）。BRCA1与TS在肿瘤石蜡组织中的表达无相关性（r=0.256,P〉0.05）。ERCC1与TS在肿瘤石蜡组织中的表达无相关性（r=0.169,P〉0.05）。结论 乳腺癌患者的血液标本也许可以替代其肿瘤石蜡组织检测BRCA1和ERCC1 mRNA的表达;BRCA1与ERCC1、TS的表达无相关性。