双重标记连接蛋白43激光共聚焦显微镜检测方法的研究

目的：探讨激光扫描共聚焦显微镜和荧光双重标记技术对心肌连接蛋白43进行定量和定位研究的方法。方法：应用罗丹明-麦芽凝集素标记心肌细胞膜,FTTC标记连接蛋白43;应用激光扫描共聚焦显微镜的检测器1和检测器2同时分别检测连接蛋白43和细胞膜,应用Image-Analysis程序进行图像分析。结果：在激光扫描共聚焦显微镜下,可以清晰地观察连接蛋白43和细胞膜,应用Image-Analysis程序能对连接蛋白43进行定量研究,连接蛋白43的分布也能同时得到研究。结论：结合应用激光扫描共聚焦显微镜和双重标记技术能对连接蛋白43进行精确的定量和定位研究,是一种先进的方法。     

激光共聚焦显微镜观察神经细胞孤啡肽受体的分布

目的：介绍激光共聚焦显微镜技术及其在观察受体细胞分布实验中的应用。方法：采用原位杂交、免疫荧光双标结合激光共聚焦显微镜技术。结果：孤啡肽受体ORL1在成年大鼠的皮层，海马及下丘脑区域的神经元，星型胶质细胞，小胶质细胞上均有表达。结论：激光共聚焦显微镜技术及免疫荧光双标技术在检测受体的细胞分布方面是一种实用的、简单的方法。     

前列腺癌中基质金属蛋白酶7和9的表达

目的探讨基质金属蛋白酶（MMP）-7,-9在前列腺癌转移侵袭中的作用,以及血管内皮生长因子（VEGF）与MMPs的关系。方法采用免疫组织化学和形态定量分析方法分析MMP-7及MMP-9表达情况,同时培养PC3M细胞并采用Boyden小室侵袭试验及酶谱分析观察MMP-9及其与VEGF在前列腺癌中的作用。结果前列腺癌各分级中MMP-7和MMP-9的表达差异均有统计学意义（P〈0.01）。Boyden小室侵袭实验显示,不同试验组穿透Matrigel的细胞数依次递减,即PC3M〉PC3M＋MMP-9Ab（1∶100）〉PC3M＋MMP-9Ab（1∶50）,差异均有统计学意义（P〈001）。酶谱分析观察发现,直接培养于培养皿表面的PC3M细胞仅有稳定的MMP-9和MMP-2酶原表达,但PC3M细胞与VEGF共孵育组条件培养基中MMP9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加。结论 MMP-7和MMP-9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。VEGF与MMPs的分泌有关,其机制有待于进一步探讨。     

激光共聚焦显微镜观察小鼠早期胚胎中蛋白激酶Cα的表达

目的 优化早期胚胎的免疫荧光染色方法并观察蛋白激酶C(PKCα)在小鼠着床前胚胎的表达和定位.方法 用优化的免疫荧光化学法结合激光共聚焦显微术,观察小鼠早期胚胎2-细胞期到囊胚期PKCα的表达情况.结果 小鼠早期胚胎自2-细胞期到囊胚期均有PKCα亚型的表达,且主要集中在早期胚胎卵裂球的核内.结论 经优化后的免疫荧光染色可清晰地检测到胚胎内PKCα集中于细胞核内表达,且分裂间期的表达高于分裂期.     

激光共聚焦显微镜观察阴道来源乳杆菌生物膜的形成

目的:采用激光共聚焦显微镜技术动态观察一株女性阴道来源卷曲乳杆菌生物膜的形成过程. 方法:使用体外盖玻片生物膜培养法,培养阴道来源卷曲乳杆菌的生物膜,在培养2、4、8、12、16、20、24、48、72、96、120 h后取出盖玻片,用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白A( fluorescein isothiocyanate-conjugatedconcanavalin A,FITC-conA)和碘化丙啶( andpropidium,PI)双重免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜( confocal laser scanning microscopy, CLSM)观察卷曲乳杆菌生物膜形成过程与特点. 结果:获得生物膜形成过程不同时间点的CLSM图像,观察到卷曲乳杆菌在4 h即开始有散在的细菌黏附于盖玻片上,为可逆吸附期;8~20 h细菌黏附量逐渐增加,进入不可逆吸附期,20 h细菌聚集成团,生物膜初步形成;24~48 h形成大片的生物膜菌落,细菌镶嵌在大量多糖基质中,结构紧密,形态稳定,生物膜成熟;72 h后生物膜菌落开始解聚. 培养20 h乳杆菌生物膜密度为42. 7 × 10 -3 ± 6. 83 × 10 -3 ,24 h上升为102.5 ×10 -3 ±23.14 ×10 -3,两者相比差异具有统计学意义(P<0.05),表明培养24 h乳杆菌生物膜形成. 结论:该株阴道来源卷曲乳杆菌在体外可形成生物膜,24 h可形成成熟的生物膜,72 h生物膜开始解聚再定植.     

成年大鼠脊髓损伤后Slit2的表达及免疫荧光激光共聚焦定位

目的:观察神经生长导向因子Slit2在大鼠急性脊髓损伤后表达变化和分布情况,探讨轴索再生导向机制。方法:成年SD大鼠用Allen’s方法制作脊髓挫伤(SCI)模型,分别于挫伤后第2,4,7,14天取材,半定量RT-PCR分析Slit2 mRNA的表达变化,免疫荧光激光共聚焦扫描观察Slit2蛋白在脊髓损伤区的分布。结果:RT-PCR显示SCI后出现Slit2转录上调,表达量持续增高并于伤后第7天达到顶峰,之后逐步下降;免疫荧光则显示Slit2阳性颗粒先后出现在脊髓损伤区灰质胶质细胞中及神经元胞膜上,以前角、中央管及中线周围和后角较为聚集。结论:成年大鼠脊髓急性损伤后存在Slit2表达一过性上调并在损伤区灰质内广泛分布,可能对再生轴索的导向性生长发挥重要作用。     

翼状胬肉的激光共焦显微镜观察

目的 翼状胬肉是常见的眼表面疾病,活体显微结构的观察有助于治疗与随访. 方法 用海德堡角膜激光共焦显微镜观察了20例原发性翼状胬肉(翼状胬肉组)以及20例正常志愿者(对照组)的结膜和角膜缘.比较了2组角膜各部分细胞数及中央厚度,并对翼状胬肉的血管、树突状细胞数与对照组的的角膜缘进行了比较. 结果 角膜激光共焦显微镜扫描的图像能清晰地观察翼状胬肉患者眼表面的超微结构,包括翼状胬肉周围角膜浅层神经的形态、上皮及其与角膜交界的边缘,翼状胬肉的基质及其血管和浸润的炎性细胞.与正常眼表面相比较,翼状胬肉生长的眼表面,其角膜基底部上皮细胞、前基质细胞、后基质细胞、内皮细胞数量以及中央角膜厚度无显著改变,翼状胬肉基质中的血管密度显著高于正常角膜缘(P＜0.05).翼状胬肉组织浅层及其边缘可见较多的树突状细胞,数量显著高于正常角膜缘(P＜0.05). 结论 角膜激光共焦显微镜可对翼状胬肉进行精确活体观察.     

激光共聚焦扫描显微镜在皮肤科的应用进展及评价

传统的皮肤病理工作通过从患者的患处获取组织后经脱水、包埋、染色、切片等过程,对其进行诊断,这是长期以来皮肤科医生公认为作为诊断金标准一种诊断方法。由于其有创、耗时较长、局限于取材组织、取材部位易形成疤痕、有感染的风险、受到样本染色等的影响,因此,创建无创诊断系统的需求日益增加。     

激光角膜共焦显微镜观察真菌性角膜炎的研究

目的:真菌性角膜炎是常见的致盲性眼病之一,在我国发病率高,其早期诊断和治疗至关重要.本研究旨在探讨激光角膜共焦显微镜在真菌性角膜炎临床诊断中的意义. 方法:对37例(37只眼)经门诊诊断为真菌性角膜炎的患眼同时行角膜组织刮片、角膜真菌培养、激光角膜共焦显微镜检查,并观察菌丝和孢子的检出情况. 结果:真菌性角膜炎组织学表现为上皮细胞缺损、神经结构破坏、基质层结构紊乱和透光度降低,菌丝表现为角膜病灶在较暗的背景中折光很强,呈明亮、杂乱无章、相互交错的线状或短棒状结构,走形类似神经组织,但较其弯曲度明显增大.病灶处见大量炎性细胞浸润.所有受检眼角膜刮片、真菌培养、激光角膜共焦显微镜检查的阳性率分别为48.7%、62.2%和78.4%;16例检查前未进行抗真菌治疗的患眼的阳性率分别为75.0%、87.5%和100%;21例检查前已行抗真菌治疗患眼的阳性率分别为28.6%、42.9%和61.9%. 结论:激光角膜共焦显微镜对真菌性角膜炎的检出具有及时、无创和高阳性率的特点,可作为真菌性角膜炎诊断的一种新的重要手段.     

激光共聚焦扫瞄显微镜检测急性白血病骨髓基质细胞Cx43表达

目的 观察急性白血病骨髓基质细胞上connexin43蛋白的表达以及GJIC功能.方法 体外培养正常及急性白血病骨髓基质细胞,采用激光共聚焦扫瞄显微镜观察二者Cx43表达的变化;采用荧光漂白恢复技术比较二者之间GJIC功能的差异.结果 正常及急性白血病骨髓基质细胞上Cx43表达的像素密度分别为(81.04±8.84)%和(34.10±17.91)%,两组间差异有统计学意义(P＜0.01).结论 急性白血病骨髓基质细胞间通讯功能较正常骨髓基质细胞明显减弱.     

利用激光共聚焦扫描显微镜观察根管外细菌的分布和活性

目的 :利用激光共聚焦扫描显微镜观察慢性根尖周炎患牙根尖区根管外细菌的分布范围和活性。方法:临床采集10例需拔除的伴有慢性根尖周炎的单根牙(实验组)和5例因正畸需要拔除的健康单根牙(对照组)。所有样本首先经LIVE/DEAD禄R Bac LightTM死活菌染色试剂盒染色,各样本包埋后由根尖向冠方切取5张1 mm厚的切片。每张切片上随机选择3个视野,用激光共聚焦扫描显微镜观察每张切片上根管外细菌的分布情况和细菌的活性。结果:对照组中,牙骨质有较弱的荧光信号,通过设定观察条件,以对照组切片上无荧光信号为基线进行观察。实验组10例样本中,8例样本的根尖区切片的牙根外表面可观察到由显示绿色荧光信号的活菌和显示红色荧光信号的死菌共同构成的根管外生物膜。根管外细菌主要分布于距根尖2~3 mm范围内的根面牙骨质上。在68%的被观察视野中,活菌的绿色荧光的强度强于死菌的红色荧光。结论:根管外生物膜由活菌和死菌共同构成,分布于部分慢性根尖周炎患牙的根尖区牙骨质外表面上。     

激光扫描共聚焦显微镜观察血小板内钙离子浓度的变化

观察血小板内钙离子浓度的变化及细胞外钙离子对其影响，为探讨血小板内Ｃａ＋＋与疾病的关系及阐明药物作用机制提供理论依据。方法用不同浓度的二磷酸腺苷（ＡＤＰ）、５－羟色胺（５－ＨＴ）、花生四烯酸、瑞斯托霉素、胶原、凝血酶诱导血小板，通过激光扫描共聚焦显微镜观察标记了Ｆｌｕｏ－３的单个血小板内钙离子变化，以及细胞外钙离子对其影响。结果（１）除凝血酶外，其余诱导剂均可引起血小板钙离子浓度变化，且随着诱导剂浓度增加，钙波动频率增加，持续时间延长；（２）ＡＤＰ引起的血小板钙波动，在细胞外无钙离子时，只是幅度减少，而无频率变化；（３）５－ＨＴ引起的钙波动，在细胞外无钙时，波动消失。结论（１）ＡＤＰ、５－ＨＴ、花生四烯酸、瑞斯托霉素、胶原可引起血小板产生钙浓度变化。（２）不同诱导剂诱发的钙波动，其钙离子来源不同。     

激光共聚焦显微镜诊断棘阿米巴角膜炎

目的探讨激光共聚焦显微镜(LSCM)在棘阿米巴角膜炎(AK)快速诊断及随访中的价值。方法回顾分析4例(4眼)AK患者的临床表现、角膜组织刮片镜检及培养、LSCM检查结果。结果 4例患者中,2例裂隙灯检查见角膜混浊、浸润,基质雾状水肿,后弹力层皱褶,角膜溃疡形成;2例表现为典型角膜基质环形浸润。角膜真菌刮片镜检及培养均无阳性病例。LSCM显示,棘阿米巴包囊位于角膜上皮下或浅层基质150μm以内;1例患者角膜内查见多个包囊,余均见1个包囊;包囊形态为圆形至椭圆形高回声结构,双层囊壁,大小为25～150μm,内核形态类圆形。经治疗,2例患者包囊消失、基质炎症减退;2例包囊变小,形态发生改变,双层囊壁结构不清;仅在1例中查见滋养体。结论 AK检查手段较多,传统角膜刮片镜检及培养等方法易受角膜取材等因素影响,阳性率较低。LSCM可用于感染角膜快速无创的活体检查,具有高分辨率、准确深度定位、动态观察、纵向断层扫描等优势,是AK病原学快速诊断及随访的重要手段。     

脑脊液中脑膜癌细胞CEA表达的研究

目的联合应用免疫荧光细胞化学技术和激光扫描共聚焦显微镜技术（LSCM）检测脑脊液中脑膜癌细胞CEA的表达部位并定量测定其荧光含量,探讨该技术在脑膜癌病诊断中的价值。方法应用免疫荧光细胞化学法以CEA标记脑膜癌细胞及对照组脑脊液细胞,采用LSCM技术获得脑膜癌细胞扫描图像并定量测定CEA荧光强度值。结果脑脊液中脑膜癌细胞的CEA表达为阳性,且部位在细胞浆中;CEA平均荧光值（36.80±17.17）,与对照组（4.87±1.86）相比差异有统计学意义（P〈0.01）。结论联合应用免疫荧光细胞化学法和LSCM检测脑脊液细胞中CEA的表达可为脑膜癌病的诊断提供可靠依据。     

激光共聚焦镜下观察天花粉蛋白进入瘤细胞的动态过程

目的:观察FITC标记的天花粉蛋白(TCS)进入瘤细胞的过程。方法:通过低温离心、丙酮分级沉淀、等电点沉淀及透析技术由新鲜栝楼根原汁中提取TCS;用FITC标记TCS,在激光共聚焦显微镜下动态观察FITC-TCS进入瘤细胞的过程。结果:纯化的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为单一带,且与标准TCS泳率相同;终浓度50μg/ml FITC-TCS的孵育3h时已经进入黑色素瘤B-16细胞,6h时FITC-TCS进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,组间差异有统计学意义(P<0.01)。FITC-TCS组与对照组(FITC-BSA)荧光强度差异有统计学意义(P<0.01)。结论:采用FITC-TCS,可在激光共聚焦显微镜下观察到进入瘤细胞的动态过程。     

胸水肺癌细胞内质网的激光共聚焦显微镜研究

目的利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）技术对胸水中肺癌细胞内质网、细胞核进行平面、立体、动态、荧光含量研究,为肺癌的诊断、鉴别诊断、细胞分化程度、来源和功能状态判断提供依据。方法将标本分为肺癌组及正常对照组,用荧光探针DioC6（3）标记内质网、DAPI标记细胞核,得到内质网断层扫描图像、荧光强度地形立体分布图及细胞核荧光扫描图,并定量测量内质网、细胞核的荧光强度值。结果肺癌组与正常对照组相比,内质网及细胞核空间立体分布均有明显差别,平均荧光值差异有统计学意义（P〈0.05）,细胞核荧光强度与核周长、核面积呈正相关。结论 LSCM技术对肺癌的诊断、鉴别诊断、细胞分化程度、来源和功能状态判断有一定的临床意义。     

应用共聚焦激光扫描技术研究阿片受体介导胞内Ca^2＋？…

目的 观察阿片激动剂急性和长时程作用于稳定ｉＮＯＳ基因的ＮＧ－ＬＮＣＸｉｎＯＳ细胞,对细胞内游离钙（〖Ｃａ＾２＋〗ｉ）的影响及Ｇ－蛋白的调节作用。方法 应用共聚焦显微镜和荧光探针Ｆｌｕｏ－３,监测单细胞〖Ｃａ＾２＋）ｉ含量。结果 δ－阿片激动剂ＤＰＤＰＥ和吗啡急性刺激细胞诱发〖（Ｃａ＾２＋〗ｉ）增加,纳洛酮对其起番转作用,用百日咳毒素预处理细胞后,吗啡急性激素不能引起〖（Ｃａ＾２＋〗ｉ增加,ＤＰＤ     

激光扫描共聚焦显微镜观察转基因马铃薯中hIL-12的表达

目的观察外源hIL-12基因在转基因马铃薯的不同组织部位的表达情况。方法采集转基因马铃薯的茎和块茎组织进行研究，以野生马铃薯为阴性对照，用间接荧光免疫标记法、激光共聚焦显微镜观察hIL-12在转基因马铃薯不同组织的表达情况。结果经激光共聚焦显微镜检测，转基因马铃薯茎与块茎中均有hIL-12的表达，而野生马铃薯中无hIL-12的表达。结论本课题组建立的人白介素-12转基因马铃薯表达体系中茎和块茎均能表达hIL-12。     

激光共聚焦显微镜检测紫花地丁水浸出物对HBV的影响

目的通过免疫荧光技术和激光共聚焦技术观察紫花地丁水浸出物对HepG2.2.15细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg的影响。方法以HepG2.2.15细胞作为研究模型,选用拉米夫定作为阳性对照药物,采用LSCM观察紫花地丁水浸出物作用3d后,免疫荧光技术标记的细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg的变化。结果紫花地丁对HepG2.2.15细胞内三种抗原均有抑制作用,且优于拉米夫定。拉米夫定对细胞内HBcAg无明显抑制作用。结论紫花地丁对HepG2.2.15细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg有抑制作用。     

激光共聚焦显微镜观察新生鼠海马齿状回神经干细胞的增殖

目的 观察新生鼠海马齿状回神经干细胞的形态及其分布.方法 新生7 d SD大鼠每天2次腹腔注射Brdu,至出生20 d及32 d分别取脑片标本,用Tritc(罗丹明)标记的麦芽凝集素及FITC标记的小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体行免疫荧光双染色,在激光共聚焦显微镜下观察大鼠海马齿状回神经干细胞的形态、分布特点及数量变化.结果 激光共聚焦显微镜观察显示,出生20 d大鼠海马齿状回Brdu阳性细胞主要聚集在颗粒下层,呈条带状分布,在海马的其他区域也有呈散在的阳性细胞存在,而出生32 d大鼠海马齿状回的神经干细胞呈散在分布,数目明显少于20 d大鼠.结论 新生SD大鼠海马齿状回存在一定数量的神经干细胞,其数量随着大鼠年龄的增大而减少.