人PDGF-A基因的克隆、表达及表达产物的纯化

目的 克隆血小板衍生的生长因子A链（PDGF-A）的基因，并在大肠杆菌中表达。方法 利用RT-PCR法，从人肝癌细胞系（HHCC）的总RNA中，扩增PDGF-A的全长cDNA，再用PCR法扩增PDGF-A成熟蛋白的全长编码序列，编码序列经测序验证后，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，构建PDGF-A的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白，并进行谷胱甘肽（GST）亲和层析纯化。结果 以RT-PCR扩增的PDGF-A基因的全长为1255bp，以PCR扩增得到其成熟蛋白的编码序列为531bp，构建了PDGF-A基因的原核高效表达载体pGEX-PDGF-A。表达产物主要位于包涵体内，对包涵体蛋白进行变性和复性处理后，利用亲和层析法获得纯化的目的蛋白，结论 成功地扩增到PDGF-A成熟蛋白的编码序列，并在大肠杆菌高效表达，为进一步对PDGF-A功能的研究提供了有利的工具。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌SPA基因的克隆、表达及纯化

目的:构建携带StaphylococcalproteinA(SPA)基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的SPA。方法:用PCR从金黄色葡萄球菌基因组中扩增SPA基因并克隆入pET32a( )载体中,在大肠杆菌BL21〈DE3〉中表达。表达产物经亲和层析进行纯化。结果:所构建的原核表达载体为高效表达载体,工程菌表达的SPA约占菌体总蛋白的40%,经亲和层析纯化后获得SPA,纯度达到99%。结论:成功地建立了制备及纯化SPA的方法,为SPA大量生产以及构建SPA融合表达体系奠定了基础。     

β-hCG蛋白在大肠杆菌系统的表达、纯化及活性鉴定

目的 获得β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)融合蛋白β-hCG/GST并验证其抗原活性.方法 利用PCR法扩增β-hCG全长基因,将其克隆至原核表达载体pET-42a中,构建重组质粒pET-42a-β-hCG,将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,亲和层析法纯化融合蛋白,目的蛋白用Western blot法鉴定,ELISA检测纯化得到的融合蛋白的抗原活性.结果 测序结果证实成功扩增出目的基因β-hCG;酶切和测序结果证实pET-42a-β-hCG原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot法及ELISA检测证实纯化后的β-hCG/GST融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功获得β-hCG/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为以β-hCG为靶位的抗肿瘤主动免疫治疗研究奠定了基础.     

3-羟酰基辅酶A脱氢酶在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的：克隆并在大肠杆菌中表达3-羟酰基辅酶A脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HCDH）并制备其抗血清。方法：通过PCR方法扩增HCDH基因片段，经DNA测序证实后克隆到原核表达载体pMAL-P2X，重组质粒转化大肠杆菌DE3，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达结果，经麦芽糖树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫獭兔，琼扩和ELISA检测抗血清的效价，Western blot检测其特异性。结果：PCR扩增得到786bp的目的片段，序列测定证实与GeneBank上登录的序列一致；成功构建了HCDH基因片段的原核表达载体；在详细探索表达条件的基础上，成功诱导HCDH的表达，并制备了相应的抗血清。结论：检测HCDH蛋白在表达水平上的变化及为HCDH基因表达调控的进一步研究奠定了基础。     

原核表达和制备EB 病毒GST/BFRF3融合蛋白用于鼻咽癌的诊断筛查

 目的：构建表达EB病毒衣壳抗原BFRF3基因的原核细胞表达载体并探讨其在鼻咽癌血清学诊断中的应用。方法：以EB病毒 DNA为模版,采用PCR法扩增目的基因BFRF3,与原核表达载体PGEX-5X-1连接,构建PGEX-5X- BFRF3重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达GST/BFRF3融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定后,纯化目的蛋白作为包被抗原,制备ELISA试剂检测鼻咽癌患者和正常人群BFRF3-IgA抗体。结果：在大肠杆菌中成功地表达了GST/BFRF3融合蛋白,相对分子质量为44 kD,免疫印迹证实目的蛋白带有免疫原性,目的蛋白经纯化后作为包被抗原检测鼻咽癌患者的灵敏度和特异度分别为65％和87％。结论：采用原核表达系统成功构建并表达了GST/BFRF3融合蛋白,其在鼻咽癌血清筛选中具有诊断价值。     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS原核表达及抗体制备

目的：构建金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白（N-terminal elastin binding proteins of S.aureus,nEBPS）的原核表达系统,制备其多克隆抗体。方法：设计引物,PCR方法扩增nEBPS基因（nebps）,分别构建克隆载体pMD19-T（＋）/nebps和原核表达载体pQE30（＋）/nebps,经PCR、双酶切和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌M15[pREP4],经1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定,经镍螯合亲和层析（Ni-NTAAgrose）纯化后再用SDS-PAGE和WB法鉴定。制备抗原,免疫新英格兰白兔,得到抗血清并对其进行鉴定。结果：pQE30（＋）/nebps重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中较高表达,纯化后得到高纯度的nEBPS,免疫动物后得到理想的多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS在构建的原核表达系统M15[pREP4]中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体。     

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的构建pCool—GST—ICAD／CAD的表达载体，并存大肠杆菌BL21（DE3）中表达具有生物学活性的CAD核酸酶？方法用PCR扩增CAD基因，将扩增产物克隆入pCool—GST—ICAD载体中构建出pCool—GST—ICAD／CAD表达载体。经酶切和电泳鉴定正确后，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化。最后用SDS—PAGE和DNA降解实验进行鉴定。结果构建了pCool—GST—ICAD／CAD原核表达载体，重组载体转化后表达出毫克级水平的GST—ICAD／CAD蛋白复合体。经分离纯化后得到纯度很好的CAD—ICAD篮白复合体，在SDS—PAGE电泳上旱现清晰的两条蛋白带。经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用。结论成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶，为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。     

The production and purification of PCR-derived recombinant simian immunodeficiency virus p27 gag protein; its use in detecting serological and T-cell responses in macaques

The polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify a region of the gag gene, encompassing the core protein p27, from genomic DNA of cells infected with SIVmac251 (32H isolate). The 767 base pair PCR product was cloned into the bacteriophage M13 and fully sequenced before sub-cloning into the expression vector pUC19. The 30 kilodalton (kDa) fusion protein of lacZ-p27 was expressed as a soluble protein in E. coli JM101 cells and purified to greater than 90% purity by affinity chromatography. The affinity purified product was used in serological and T-cell assays to assess immune function in cynomolgus macaques immunised or challenged with immunodeficiency virus derived material. This reagent and accompanying methods provide valuable assays for monitoring the efficacy of vaccines for SIV as a model for human AIDS.     

EGFR二聚化B细胞表位抗原肽基因克隆、表达与纯化

目的利用基因工程手段建立表皮生长因子受体(EGFR)二聚化B细胞表位抗原肽MVF-ER的高效制备方法。方法采用重叠延伸PCR扩增MVF-ER后克隆于表达载体pET32a,于大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,产物采用肠激酶酶切和镍离子螯合亲和层析法纯化。结果通过10对引物5步重叠延伸得到273 bp的扩增产物,目的基因与硫氧环蛋白(Trx)融合后可高效表达,经酶切和层析后得到纯度为95%的抗原肽。结论成功建立抗原肽"MVF-ER"的高效制备方法,为进一步研究EGFR过表达恶性肿瘤的治疗性疫苗打下了坚实基础。     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...     

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。     

人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测

为了获取神经营养素 -3 (NT-3 )将之用于神经系统疾病的治疗 ,采用 RT-PCR技术 ,从人胎脑组织特异性扩增并克隆了人 NT-3全长以及成熟蛋白编码基因 ,将其分别克隆至表达载体 pc DNA3 .1与 p ET2 8a,构建了重组真核表达载体 pc DNA3 .1-NT3和重组原核表达载体 p ET2 8-NT3 s。 pc DNA3 .1-NT3经脂质体介导转染至大鼠胚胎脑纹状体神经胶质细胞 ,以 G418筛选出抗性阳性克隆 ,该克隆株与大鼠胚脑纹状体神经干细胞体外共培养 5 d,MAP-2 (微管相关蛋白 2 )免疫细胞化学反应结果显示 ,转染细胞株所表达的 NT-3蛋白具有生物学活性 ,可促进共培养的纹状体神经干细胞的突起生长。将 p ET2 8-NT3 s转化大肠杆菌 ,以 IPTG诱导 ,获得了相对分子质量约 18k D的 6XHis-NT3融合蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %左右。经镍柱亲和纯化 ,得到纯度达 95 %的 rh NT-3蛋白 ,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备

目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因,并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性。方法:应用RTPCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBPcDNA。测序后将其克隆到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。表达产物经NiNTA亲和层析柱纯化后,用SDSPAGE进行鉴定。以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔,制备兔抗PBP抗体。抗体的效价及特异性用Westernblot进行测定和分析。结果:扩增和克隆出了720bp的PBP基因。构建的重组质粒pET28aPBP在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中,纯化的PBP经SDSPAGE鉴定呈单一条带。以纯化的PBP免疫兔,制备了兔抗PBP抗体。Westernblot鉴定证实,该抗体可与原核表达的PBP特异性结合,抗体效价为1∶1600。结论:在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP,并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体,为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础。