槐定碱对内毒素肺损伤小鼠p38MAPK的影响

目的探讨内毒素（细菌脂多糖,LPS）肺损伤小鼠肺组织p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）表达的变化以及槐定碱对其影响。方法 60只BALB/c小鼠,除正常对照组、槐定碱对照组外,内毒素肺损伤模型组（LPS模型组）、槐定碱治疗高（12mg.kg-1）、中（6mg.kg-1）、低（3mg.kg-1）剂量组的BALB/c小鼠均尾静脉注射LPS制备急性肺损伤模型,注射后30min再分别腹腔注射生理盐水或槐定碱12、6、3mg.kg-1,各组均处理后6h取材,肉眼及光镜观察肺组织的病理变化,免疫组化SP法检测肺组织中总p38、磷酸化p38的表达,硝酸还原酶法检测血清NO含量。结果 LPS模型组肺脏病理改变明显加重,肺组织总P38和磷酸化p38的表达均增多和增强（P〈0.01）;血清NO显著升高（P〈0.01）;槐定碱三个剂量治疗组病理损伤均不同程度改善,总P38表达与LPS组比较差异无统计学意义,但磷酸化p38表达均显著小于模型组（P〈0.01）,血清NO含量显著低于LPS模型组（P〈0.01）。结论 p38MAPK参与了内毒素肺损伤的发病过程,槐定碱的抗内毒素肺损伤机制可能与下调p38MAPK的表达,抑制NO的释放有关。     

槐定碱对小鼠巨噬细胞TLR4及JNK/c-jun mRNA表达的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞表达TLR4、JNK和c-jun mRNA及分泌TNF-α的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW 264.7巨噬细胞,实验分为4组:空白对照组、槐定碱对照组、LPS组、槐定碱预处理组,用RT-PCR技术检测RAW 264.7细胞TLR4、JNK和c-jun的mR-NA表达量,放免法检测细胞培养液TNF-α分泌量。结果槐定碱对RAW 264.7巨噬细胞TLR4、JNK、c-jun的mRNA及细胞培养液中TNF-α基础表达无影响,但对经LPS激活的巨噬细胞的TLR4、JNK mRNA表达有显著抑制作用(均P<0.01),c-jun mRNA表达亦降低,但与LPS模型组比较差异尚无统计学意义。槐定碱预处理组细胞液中TNF-α含量显著低于LPS模型组(P<0.01)。结论槐定碱抗内毒素机制与其抑制LPS引起的TLR4、JNK的mRNA高表达,并减少TNF-α分泌有关。     

槐定碱预防小鼠内毒素性肝损伤的作用及对肝脏CD14、TLR4表达的影响

目的 研究预防性给予槐定碱对小鼠内毒素血症急性肝损伤的影响及对CD14、TLR4表达的调节.方法 观察槐定碱12、6、4mg/kg三个剂量预防性处理的小鼠,在给予内毒素后2、6、12、24h时各组小鼠一般状况、肉眼及光镜下肝组织的病理变化,赖氏法测定血清丙氨酸氨基转氨酶(ALT)浓度,RT-PCR与Western Blot分别检测肝组织CD14及TLR4的mRNA与蛋白表达,放免法检测血清TNF-α含量的变化.结果 槐定碱三个剂量预防性给予,各个时间点结果均表明改善了内毒素血症模型小鼠的一般状况,减轻了肝组织病理改变;槐定碱三个剂量组的ALT值均低于同时间点的LPS模型组(P<0.01或P<0.05);槐定碱三个剂量组与同时间点LPS模型组比较,均下调肝组织CD14、TLR4 mRNA和蛋白的表达(P<0.01或P<0.05);槐定碱三个剂量组血清TNF-α水平均较同时间点LPS模型组降低(P<0.01或P<0.05),并在24h时均降至正常对照组水平.结论 槐定碱12、6、4mg/kg三个剂量预防性给予,可抑制内毒素血症小鼠肝脏炎症反应,其机制可能与下调LPs识别受体CD14、TLR4表达,并进而抑制下游炎症因子分泌有关.     

槐定碱对小鼠巨噬细胞TLR4及JNK/c-jun mRNA表达的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞表达TLR4、JNK和c-jun mRNA及分泌TNF-α的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW 264.7巨噬细胞,实验分为4组：空白对照组、槐定碱对照组、LPS组、槐定碱预处理组,用RT-PCR技术检测RAW 264.7细胞TLR4、JNK和c-jun的mR-NA表达量,放免法检测细胞培养液TNF-α分泌量。结果槐定碱对RAW 264.7巨噬细胞TLR4、JNK、c-jun的mRNA及细胞培养液中TNF-α基础表达无影响,但对经LPS激活的巨噬细胞的TLR4、JNK mRNA表达有显著抑制作用（均P〈0.01）,c-jun mRNA表达亦降低,但与LPS模型组比较差异尚无统计学意义。槐定碱预处理组细胞液中TNF-α含量显著低于LPS模型组（P〈0.01）。结论槐定碱抗内毒素机制与其抑制LPS引起的TLR4、JNK的mRNA高表达,并减少TNF-α分泌有关。     

槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞表达NF-κB的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65、TNF-α表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7细胞,分为空白对照组、槐定碱预处理对照组、LPS模型组、槐定碱预处理+LPS组。各组处理完毕后5、30、60、120min,分别获取细胞与细胞培养液。Western Blot和RT-PCR分别检测细胞NF-κB p65蛋白与mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果单独槐定碱对NF-κB p65以及TNF-α表达无影响;LPS模型组各时间点NF-κB p65 mRNA与蛋白以及TNF-α表达均显著高于空白对照组(P<0.01),且随LPS刺激时间延长而持续升高,至120min未见下降;槐定碱预处理+LPS组NF-κB p65mRNA与蛋白及其下游TNF-α表达均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论槐定碱预处理可通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB p65表达及TNF-α分泌发挥抗炎作用。     

Toll样受体4单克隆抗体对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜中促炎因子及信号传导通路的影响

目的探讨Toll样受体4单克隆抗体(TLR4mAb)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜的促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-1β以及信号传道通路P38MAPK、磷酸化P38MAPK、c-fos、c-jun蛋白表达情况的影响。方法18只BALB/c小鼠分为对照(A)、急性期溃疡性结肠炎模型(B)及干预(C)组。A组小鼠饮用蒸馏水7 d;B、C组小鼠饮用5%DSS水溶液7 d,以产生急性期溃疡性结肠炎模型。C组小鼠在造模开始的同时,腹腔内注射TLR4mAb,观察其干预作用。造模及干预7 d后处死小鼠,观察指标包括疾病活动指数(DAI)、结肠组织病理学炎症损伤评分(HPS),采用逆转录-聚合酶链反应检测各组结肠黏膜TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、IL-1βmRNA表达,采用Western印迹法测定各组结肠黏膜P38MAPK、磷酸化P38MAPK、c-fos、c-jun蛋白表达。结果①造模第8天,B组的DAI明显高于A、C组(P值均<0.01),A与C组间的差异无统计学意义(P>0.05)。C组小鼠予TLR4mAb干预1周后,HPS明显小于B组(P<0.01),而与A组的差异无统计学意义(P>0.05)。②B组TNF-αmRNA、IFN一γmRNA和IL-1βmRNA均显著高于A和C组(P值均<0.01),而后两组间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。③B组的P38MAPK蛋白、c-jun蛋白表达明显高于A组(P值均<0.01)和C组(P值分别<0.01和0.05),后两组间的差异也有统计学意义(P值均<0.01)。3组间磷酸化P38MAPK、c-fos蛋白表达的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论TLR4mAb可能通过抑制TLR4-P38MAPK-c-fos/c-jun信息传导通路,降低信号传导通路中P38MAPK、c-jun蛋白的表达,下调小鼠结肠黏膜促炎因子TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、IL-1βmRNA表达而发挥其干预作用。     

槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞表达NF-κB的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65、TNF-α表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7细胞,分为空白对照组、槐定碱预处理对照组、LPS模型组、槐定碱预处理＋LPS组。各组处理完毕后5、30、60、120min,分别获取细胞与细胞培养液。Western Blot和RT-PCR分别检测细胞NF-κB p65蛋白与mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果单独槐定碱对NF-κB p65以及TNF-α表达无影响;LPS模型组各时间点NF-κB p65 mRNA与蛋白以及TNF-α表达均显著高于空白对照组（P〈0.01）,且随LPS刺激时间延长而持续升高,至120min未见下降;槐定碱预处理＋LPS组NF-κB p65mRNA与蛋白及其下游TNF-α表达均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论槐定碱预处理可通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB p65表达及TNF-α分泌发挥抗炎作用。     

p38丝裂原活化蛋白激酶在小鼠肠缺血再灌注肺损伤中的作用

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在小鼠肠缺血再灌注肺损伤的作用。方法10周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和缺血再灌注+SB239063处理组(SB239063组),SB239063组于术前1h腹腔注入p38MAPK抑制剂SB239063(3mg/kg),另两组注入等量生理盐水。采用夹闭C57BL/6小鼠肠系膜前动脉45min后再灌注6h的方法造成肠缺血再灌注损伤模型。处死小鼠取肺标本,蛋白质印迹法检测肺组织磷酸化p38MAPK蛋白水平,RT-PCR检测肺组织TNF-α和IL-1βmRNA表达,H-E染色观察肺组织病理学改变。结果肠缺血再灌注导致明显肺损伤,肺组织p38MAPK活化明显增加,TNF-α和IL-1β基因表达水平明显升高(与假手术组比较P<0.01);SB239063可抑制肺组织p38MAPK活化,减轻小肠缺血再灌注引起的肺损伤,并下调肺组织TNF-α和IL-1βmRNA表达(与缺血再灌注组比较P<0.05)。结论p38MAPK在小鼠肠缺血再灌注肺损伤中起重要作用,抑制p38MAPK活化可减轻肠缺血再灌注肺损伤。     

槐定碱对内毒素肝损伤小鼠ERK和TNF-α表达的干预作用

目的观察槐定碱对急性内毒素肝损伤小鼠的干预效应及对磷酸化ERK（pERK）、TNF-α表达的影响。方法以内毒素肝损伤小鼠为实验对象,记录各组小鼠一般情况,肉眼及HE染色光镜观察小鼠肝组织病理改变,免疫组化检测肝组织中pERK的表达与分布,放射免疫法检测血清TNF-α。结果槐定碱3个剂量干预组小鼠一般情况改善,肝组织病理改变减轻,中、高剂量组肝组织中pERK核移位现象及pERK阳性细胞数较LPS组显著减少（P〈0.01）,与正常对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）;中、高剂量组小鼠血清TNF-α水平均显著低于LPS组（P〈0.01）,而与正常对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论槐定碱干预对急性内毒素肝损伤小鼠具有明显保护作用,其机制与抑制肝组织中pERK及血清TNF-α的表达有关。     

槐定碱抗内毒素效应的初步研究

目的探讨槐定碱的抗内毒素（ET）作用.方法鲎试剂显色基质法定量测定槐定碱体外降解ET的作用,复制内毒素肺损伤小鼠模型,以小鼠一般状况、白细胞计数、肺W/D比值、肺组织病理形态学改变以及血清肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）含量,观察槐定碱抗内毒素的体内效应.结果槐定碱浓度为5μg/mL时对ET的降解率为79.34%,在0.625～5μg/mL范围内呈现剂量依赖性.槐定碱可改善内毒素肺损伤小鼠的一般状况,使白细胞回升（均P＜0.05）,肺W/D比值下降（P＜0.05）,减轻肺组织病理损伤,降低TNF-α和IL-6含量（P＜0.05）.结论槐定碱具有直接拮抗内毒素作用,并可减轻内毒素肺损伤小鼠的病理损害.