京大戟毒性部位及其醋制前后成分变化研究

为比较京大戟不同极性部位的肠道毒性作用,分析毒性部位醋制前后成分变化规律,该实验以95%乙醇提取京大戟,石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取得不同极性部位。不同极性部位小鼠灌胃3 h后,测定粪便含水量及十二指肠、空肠、回肠、结肠含水量,考察不同极性部位对小鼠腹泻及肠道水肿的影响;采用MTT法比较不同极性部位对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6细胞的增殖抑制作用,并采用RT-PCR法测定结肠中水通道蛋白AQP1,AQP3的mRNA表达水平,考察不同极性部位的毒性。研究结果显示,与空白组相比,京大戟醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位均可导致小鼠粪便含水量及十二指肠及结肠的含水量增高,石油醚部位作用最强。京大戟95%醇提物、石油醚部位对IEC-6细胞具有显著的增殖抑制作用,IC₅₀分别为95.03,33.75 mg·L^-1;京大戟95%醇提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位均能导致结肠中AQP1的mRNA表达降低、AQP3的mRNA表达增高。表明京大戟可导致小鼠腹泻及肠道水肿,其作用与导致水通道蛋白AQP1,AQP3的mRNA表达水平变化相关;并可抑制IEC-6细胞增殖;京大戟的主要毒性部位为石油醚部位,通过成分分离及炮制前后成分变化比较,发现毒性的降低可能与石油醚部位的二萜类成分含量下降相关。     

四君子汤总多糖对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6迁移的影响

目的:观察四君子汤总多糖(PPS)在黏膜损伤后对小肠上皮细胞修复的影响。方法:采用大鼠小肠上皮细胞株IEC-6制成细胞迁移模型,观察四君子汤PPS在造模后0 h8、h及24 h对细胞迁移面积的影响。结果:四君子汤在细胞迁移的8 h及24 h,对IEC-6的细胞迁移均有促进作用。而其最佳剂量集中于100~400μg/ml范围内。结论:四君子汤可促进胃肠道黏膜损伤的修复,其机制与促进细胞迁移有关。     

醋制降低京大戟对人正常肝细胞LO2的毒性及机制研究

目的:比较京大戟醋制前后对人正常肝细胞LO2的毒性作用,并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养LO2细胞,用不同浓度的京大戟生品和醋品对其进行处理,MTT法测定各样品对LO2细胞增殖的抑制作用;Hoeehst 33258荧光染色法观察细胞凋亡的形态学改变;AnnexinV/PI染色流式细胞术检测LO2细胞凋亡;PI染色流式细胞术分析其对细胞周期的影响;检测细胞培养液上清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活力,细胞裂解上清超氧化歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量.结果:与阴性对照组比较,京大戟生品各浓度组均可抑制LO2细胞增殖,诱导细胞凋亡,引起细胞S期阻滞(P＜0.05);能显著升高细胞培养液上清ALT,AST,LDH活力(P＜0.05),显著降低细胞裂解上清SOD活性和GSH含量、增加MDA含量.醋制后,与京大戟生品组比较,可显著降低细胞凋亡率、降低细胞周期阻滞,显著降低细胞培养液上清ALT,AST,LDH活力(P＜0.05),显著升高细胞裂解上清SOD活性和GSH含量、显著降低MDA含量.结论:醋制可降低京大戟对LO2细胞的毒性,其机制可能是减轻氧化损伤,从而降低细胞周期阻滞,减少细胞凋亡.     

醋炙降低芫花二氯甲烷部位对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6毒性的研究

该实验以大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6为研究对象,比较醋炙前后芫花二氯甲烷部位对IEC-6细胞的毒性差异,初步探讨芫花醋炙减毒的机制。通过MTT法筛选芫花各极性部位对于IEC-6细胞毒性,比较醋炙前后芫花毒性部位对IEC-6细胞活性的影响;通过测定IEC-6细胞中的乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、Na~+-K~+-ATP酶,Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶等酶的活力和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量评价IEC-6细胞氧化损伤程度;使用流式细胞术检测IEC-6细胞的细胞周期和细胞凋亡情况。结果表明芫花二氯甲烷部位为致IEC-6细胞的毒性部位,醋炙后二氯甲烷部位毒性显著降低(P0.01)。与空白组相比,芫花二氯甲烷部位可显著降低IEC-6细胞中Na~+-K~+-ATP酶、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶、SOD活力(P0.01),显著提高细胞上清液LDH,MDA含量,显著降低细胞中GSH的含量(P0.01)。同时,芫花二氯甲烷部位能显著提高IEC-6细胞的早期与晚期凋亡率,显著降低G1期细胞百分比,增加S与M期细胞百分比(P0.01)。醋炙后,与相应芫花生品二氯甲烷组相比,醋芫花二氯甲烷组可显著提高IEC-6细胞内Na~+-K~+-ATP酶、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶、SOD活力(P0.01),显著降低细胞中LDH,MDA含量(P0.01),显著提高细胞中GSH含量(P0.01)。显著降低IEC-6细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率(P0.01),显著增加G1期细胞百分比,减少S与M期细胞百分比(P0.01)。提示醋炙可降低芫花二氯甲烷部位致IEC-6细胞的毒性,其可能机制为提高细胞中抗氧化酶的活性与细胞膜的通透性,降低氧化损伤而实现。     

白芍总苷对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6基因表达谱影响的研究

目的：本研究主要观察白芍总苷（TGP）对大鼠小肠上皮细胞基因表达谱的影响，以期进一步了解TGP的作用机制。方法：采用基因芯片技术观察给予TGP前后大鼠小肠上皮细胞株IEC-6基因表达谱的变化情况。结果：在给予TGP后，大鼠IEC-6细胞株共有48条基因表达出现明显差异。其中9条基因表达上调，37条基因表达下调，分别涉及包括细胞分化发育、细胞增殖、粘附等方面的基因。结论：TGP可通过多种途径影响小肠上皮细胞功能。我们的研究为TGP治疗自身免疫性疾病提供了基因水平的依据。     

四君子汤总多糖及单味药多糖对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6细胞迁移作用的比较研究

目的：研究四君子汤总多糖及各单味药多糖对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6细胞研究迁移的影响。方法：以IEC-6细胞为研究对象，采用体外细胞迁移模型，观察四君子汤总糖及各单味多糖对该细胞迁移的影响。结果：各多糖作用存在差异，茯苓多糖具有明显抑制细胞迁移的作用，白术多糖作用不显著，甘草多糖和党参多糖具有明显促进细胞迁移的作用。当各单味药多糖与总多糖相比时，总多糖的效用优于各单味药多糖。结论：四君子汤总多糖的作用可能是各单味药多糖综合作用的结果，也提示中药复方用药具有一定的合理性。     

甘草黄酮提取物对小肠上皮细胞IEC-6迁移及多胺的影响

目的 观察甘草黄酮提取物对小肠隐窝上皮细胞IEC-6迁移及迁移过程细胞内多胺量的影响。方法 划痕法制备细胞迁移模型,观察在多胺合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）及钾通道抑制剂4-氨基吡啶（4-AP）存在情况下,甘草黄酮提取物对细胞迁移的影响;柱前衍生-高效液相色谱法检测IEC-6细胞在正常及DFMO存在条件下,给予甘草黄酮提取物12、24 h后细胞内多胺（精脒）的量。结果 甘草黄酮提取物可逆转DFMO或4-AP所致IEC-6细胞迁移抑制;其给药12、24 h后可提高细胞内精脒的量,并逆转DFMO对多胺合成的抑制。结论 甘草黄酮提取物促进细胞迁移的作用与影响细胞内多胺调控信号通路有关。     

4种中药提取物对大鼠小肠上皮细胞IEC-6增殖及其葡萄糖吸收的影响

目的 利用大鼠小肠上皮细胞系(IEC-6),研究单味中药提取物对小肠上皮细胞增殖和葡萄糖吸收转运功能的调控作用.方法 藿香、苍术、黄柏和石膏等4种中药被定向提取,MTT细胞增殖试验筛选提取物的适宜作用质量浓度,测定各处理组细胞的葡萄糖吸收率和Na+,K+-SATP酶活性,同时采用荧光定量PCR技术分析细胞中钠-葡萄糖共转运载体(SGLT1)、葡萄糖转运载体2(GLUT2)和Na+,K+-ATP酶的mRNA表达量.结果 各中药提取物对大鼠小肠上皮细胞增殖的影响与其作用质量浓度有关.50μg/mL苍术挥发油和10μg/mL黄柏生物碱可提高IEC-6细胞葡萄糖的吸收功能,并显著上调了SGLT1和Na+,K+-ATP酶mRNA表达量;50μg/mL藿香挥发油促进了细胞的葡萄糖吸收,但仅对GLUT2的基因表达有上调效应(P<0.05);而50μg/mL石膏水提物对细胞葡萄糖的吸收无促进作用(P>0.05).结论 苍术挥发油、藿香挥发油和黄柏生物碱对细胞增殖和葡萄精吸收均有促进作用,但其影响机制并不完全一样.     

人参皂苷对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠TNF-α及IL-6影响的研究

目的:观察人参皂苷对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠血清甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6的影响。方法:40只Wistar大鼠随机分为5组,每组8只,即正常组、模型组、人参皂苷低、中、高剂量组。除正常组外,其余4组以猪甲状腺球蛋白造模,造模成功后,人参皂苷各剂量组以相应剂量人参皂苷灌胃,正常组及模型组以蒸馏水灌胃,8周后酶联免疫法检测TGAb、TPOAb、TNF-α及IL-6的水平。结果:与正常组比较,模型组的TGAb、TPOAb显著增加(P<0.05)。与模型组比较,人参皂苷各剂量组TGAb、TPOAb均下降,其中低剂量与中剂量有显著性意义(P<0.05),高剂量组差异无显著性意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组TNF-α显著增加(P<0.05);与模型组比较,人参皂苷各剂量组的TNF-α均下降,差异均有显著性意义(P<0.05);但各剂量组间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组的IL-6显著下降(P<0.05);与模型组比较,人参皂苷各剂量组IL-6均有所上升,但差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:人参皂苷能降低甲状腺自身抗体指标,其作用机制可能通过抑制Th1细胞功能的过度亢进,调节免疫的途径来保护甲状腺组织。     

京大戟醋制前后对斑马鱼胚胎的急性毒性研究

采用模式生物斑马鱼的胚胎评价京大戟醋制前后各提取物急性毒性,同时以大戟二烯醇为对照品测定了各提取物的总萜含量。选取24 h发育正常的斑马鱼胚胎,每个提取物设8个浓度和一个空白对照组,并观察给药后96 h斑马鱼胚胎的发育和死亡情况,计算不同样品对斑马鱼胚胎的半数致死浓度(LC_(50))。结果显示对于斑马鱼胚胎,京大戟醋制前后各提取物均有急性毒性,与生品相比,醋制后毒性显著降低。不同提取方式中,醇提物毒性大于水提物;不同极性部位中毒性大小依次为石油醚二氯甲烷乙酸乙酯正丁醇、剩余部位。结合萜类成分含量测定结果可推测萜类成分为京大戟主要毒性成分,且其毒性大小与萜类成分的含量呈正相关。表明斑马鱼胚胎模型适用于京大戟毒性评价,为进一步认识与评价京大戟的毒性成分及醋制减毒的作用机制提供合适的研究方法以及理论依据。     

醋制降低甘遂对人正常肝细胞LO2毒性研究

目的:比较甘遂醋制前后对人正常肝细胞LO2的毒性差异,初步探讨甘遂醋制减毒机制。方法:以人正常肝细胞LO2细胞为研究对象,采用MTT法检测甘遂醋制前后对LO2细胞活性的影响,采用倒置显微镜观察细胞形态;并测定细胞培养上清液和裂解上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、Na+-K+-ATP酶,Ca2+-Mg2+-ATP酶等酶的活力和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。结果:与阴性对照组比较,生甘遂可明显降低LO2细胞的活性(P<0.01)与形态,并显著提高LO2细胞培养上清液中ALT,AST,LDH活力(P<0.01)、显著降低SOD活力和GSH含量(P<0.01),显著增加MDA含量(P<0.01),显著降低LO2细胞裂解上清液中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力(P<0.01);醋制后,与生甘遂各剂量组比较,醋甘遂可显著降低生甘遂对LO2细胞的增殖抑制作用(P<0.01)和形态变差的趋势,可显著降低LO2细胞培养上清液中ALT,AST,LDH活力(P<0.01)、显著增加SOD活力和GSH含量(P<0.01)、显著降低MDA含量(P<0.01)、显著提高LO2细胞裂解上清液中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力(P<0.01),且呈一定的剂量相关性。结论:醋制可降低甘遂肝毒性,其可能机制为通过降低甘遂对肝细胞膜通透性的影响及减轻氧化损伤而实现。     

防风对大鼠和小鼠胃肠运动的抑制作用及机制研究

目的观察防风(RS)对大小鼠胃肠运动的抑制作用并探讨其机制。方法采用苯酚红测定法观察RS对小鼠胃肠运动的影响;制备大鼠结肠平滑肌肌条并放置在浴槽中,滴加RS及其他试剂并记录肌条的收缩曲线加以分析;分离并培养大鼠结肠平滑肌细胞,探针孵育后,不同缓冲液条件下测定NS及RS处理前后细胞的荧光值并加以分析。结果 RS各组对小鼠小肠推进和胃排空均有抑制作用;RS各组均抑制离体大鼠结肠平滑肌肌条收缩,抑制Ach引起的肌条收缩。RS剂量与峰高和同线下面积有量效关系。不同缓冲液对RS处理后的荧光值和抑制率有显著性差异。结论防风可抑制小鼠小肠推进及胃排空,抑制离体大鼠结肠平滑肌收缩,机制与肾上腺素能α受体及M胆碱受体有关,与阿片受体和β受体无关;防风可降低细胞内游离钙离子浓度,其机制与抑制细胞外钙离子内流有关,与抑制细胞内钙离子释放无关。     

党参、甘草皂苷和黄酮部位对IEC-6细胞迁移的影响

目的:观察党参、甘草的皂苷和黄酮提取部位对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移的影响。方法:以回流提取法分别提取党参和甘草的皂苷、黄酮部位,并用D101大孔吸附树脂对各部位进行分离纯化,以分光光度法检测含量。IEC-6细胞种植于6孔板并培养24小时,划痕法造细胞迁移模型,划痕后加入各种受试药,24小时后观察细胞迁移情况。结果:党参和甘草黄酮含量(以芦丁计)分别为41.73%和50.98%;党参皂苷含量(以人参皂苷Re计)为40.57%;甘草皂苷含量(以甘草酸计)为57.01%。50mg/L的党参黄酮部位和甘草黄酮部位能促进细胞迁移(P<0.05);党参和甘草的皂苷部位对细胞迁移无明显影响。结论:党参、甘草黄酮部位有促进IEC-6细胞迁移作用,党参、甘草皂苷部位对IEC-6细胞迁移无明显影响。     

醋甘遂饮片炮制工艺研究

目的:确定醋甘遂饮饮片的最佳炮制工艺.方法:以甘遂的毒效成分之一的3-O-(2'E,4'Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇为指标性化合物,利用HPLC法,以醋的用量、炒制温度和炒制时间为考察指标,采用正交试验法L_9(3~4)优选出了醋甘遂饮片的最佳炮制工艺.结果:醋甘遂的炮制工艺,醋的用量为30%,炒制温度控制在260℃,炒制时间9 min.结论:优选出的醋甘遂炮制工艺稳定可行,重现性好.     

商陆正丁醇部位醋制前后肠道毒性变化研究

为探索商陆毒性部位炮制前后对肠道毒性变化的影响,提取分离获得了商陆正丁醇毒性部位,在整体动物模型水平,灌胃给药后观察小鼠肠道肿胀程度,测定小鼠肠道不同部位的含水量及粪便的含水量,考察商陆正丁醇部位炮制前后对腹泻及肠道肿胀的影响;在细胞水平,采用MTT法,测定肠细胞HT-29,IEC-6的IC50,比较醋制前后商陆正丁醇部位的毒性变化。结果显示商陆正丁醇部位能够导致肠道肿胀,表现为引起十二指肠、空肠的水肿,且可导致粪便含水量增加引起腹泻,可抑制肠细胞HT-29,IEC-6增殖,表明其具有肠细胞毒性,对HT-29细胞的IC5014.59 mg·L-1,IEC-6 IC5043.77 mg·L-1;经醋制,小鼠肠道肿胀程度显著减弱,肠道和粪便的含水量明显降低,对HT-29和IEC-6的抑制作用减轻,对HT-29细胞的IC5058.51 mg·L-1,IEC-6 IC5084.37 mg·L-1。由此可知,醋制法具有降低商陆正丁醇部位的毒性作用。     

藤黄炮制品对大鼠肠道组织病理学研究

目的:观察藤黄各制剂单次大剂量ig给药后大鼠消化系统病变情况,并比较藤黄炮制前后对大鼠肠上皮细胞株IEC-6毒性差异,探讨藤黄炮制减毒机制.方法:单次ig给予藤黄生品(200 mg· kg-1)、清水制藤黄(200 mg· kg-1)和藤黄酸(50 mg· kg-1),观察给药后大鼠的活动情况,于24 h后处死并采集大鼠心、肝、肾、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠等主要脏器,观察大鼠口服给药后消化系统病变情况.以大鼠肠上皮细胞株IEC-6为研究对象,采用MTT法检测藤黄炮制前后对IEC-6细胞增殖的影响,采用倒置显微镜观察细胞形态.结果:病理切片结果显示,给药后大鼠的肝脏、肾脏、心脏、胃和食道均未见明显的毒性反应;但十二指肠、空肠有轻度至重度的毒性作用,表现为肠绒毛水肿.3种藤黄制剂均会引起给药大鼠肠道的毒性作用,生品藤黄所致的十二指肠和空肠水肿程度最严重,其次是清水制藤黄和藤黄酸.细胞的毒性结果显示,与空白组相比,藤黄生品及炮制品均可明显降低IEC-6细胞的活性(P＜0.01)与形态,且呈一定的剂量相关性;与藤黄生品组相比,藤黄3种炮制品组对IEC-6细胞的增殖抑制作用(P＜0.01)和形态变差的趋势均显著性降低.结论:藤黄单次大剂量ig给药后大鼠的病理变化及IEC-6细胞的毒性作用结果表明,藤黄经炮制后毒性显著降低.     

甘草与白术配伍对IEC-6细胞p53,p21基因表达的影响

通过研究不同剂量甘草与白术配伍对DFMO模型小肠上皮细胞(IEC-6)增殖及p53,p21 mRNA和蛋白表达的影响,探讨甘草与白术配伍对细胞增殖影响的分子基础.采用流式细胞术分别检测药物对IEC-6细胞分裂速度及细胞周期的影响,qRT-PCR检测药物对IEC-6增殖相关基因p53,p21 mRNA的影响,Western blot检测药物对IEC-6细胞p53,p21蛋白表达的影响.白术颗粒可上调DFMO模型IEC-6细胞内p53,p21 mRNA和蛋白的表达水平;而甘草颗粒与白术颗粒不同比例配伍均能显著下调单独白术颗粒作用对DFMO模型IEC-6细胞p53,p21 mRNA和蛋白表达的影响,促进IEC-6细胞的增殖.对于DFMO模型IEC-6细胞,配伍用药甘草能调和白术对小肠上皮细胞的影响.     

三氧化二砷治疗大鼠C6脑胶质瘤的研究

目的：研究三氧化二砷(As₂O₃)体内外抑制脑胶质瘤生长的作用。方法：将不同浓度As₂O₃(1,2,4,6,8 μmol·L^-1)加入体外培养的C6脑胶质瘤，MTT法检测体外细胞增殖率，PCNA染色检测细胞增殖活性、TUNEL法检测原位细胞凋亡和Western印迹检测Bc1-2蛋白表达水平。另将大鼠C6胶质瘤细胞(5×10⁵个/15 μL)种植于雄性SD大鼠右侧尾状核(模型组、治疗组各10只)，治疗组荷载C6脑胶质瘤鼠用前面筛选的浓度(1 mmol·L^-1)实施肿瘤原位治疗，对照组仅注入生理盐水，观察动物一般情况、生存期、MRI动态变化及病理改变。结果：与模型组和低浓度组相比，中、高浓度治疗组C6细胞增殖明显下降(P<0.01)，TUNEL法表明细胞凋亡指数上升(P<0.01)；Western印迹显示凋亡相关基因Bcl-2蛋白表达水平呈下降趋势。模型组动物均于3周内死亡(17.8±0.92) d；治疗组8只动物死于24～36(32.1±1.35) d；余2只第120天时处死。治疗组MRI检查：4周时扫描的4只动物，1只瘤体有缩小，另3只瘤体变化不大；8～12周时，残存2只动物，1只瘤灶基本消失，1只残存小瘤灶。结论：As₂O₃具有体内外抑制脑恶性胶质瘤生长的作用，有可能成为临床治疗胶质瘤的候选化疗药物之一。