应用酵母双杂交研究G-CSF受体胞内区结合蛋白

目的：探寻与G-CSF受体胞内区相互作用的下游蛋白因子，揭示G-CSF受体信号转导通路的可能机制。方法：采用敏感性较高的酵母双杂交体系，筛选小鼠胎肝文库，并通过体内双杂交实验进行验证。结果：获得了11种阳性基因片段，对其中铁蛋白重链片段在体内验证了相互作用。结论：提示在小鼠胎肝中G-CSF受体作为胞内信号转导的起始点，与众多胞浆内蛋白因子相结合，对于揭示G-CSF受体信号转导可能存在的各种通路起到重要的提示作用。     

hPeriod1PAS结构域相互作用蛋白的筛选和研究

目的寻找与近日节律系统核心基因Period1（Per1）相互作用的新蛋白,揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法,以人Per1的PAS结构域为诱饵,扫描人下丘脑cDNA文库,并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用;通过RT—PCR检测RACK1（receptors for activated Ckinase）表达的组织特异性及节律性;运用RNAi技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用;RACK1在多器官组织保守表达,但其表达未呈现明显节律性;上调及下调Per1表达,RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白,可能介导、调控Per1的功能。     

一种新的抗辐射性相关蛋白AAl2和CHKl相互作用研究

目的：研究AAl2蛋白与CHKl蛋白的相互作用。方法：用在大肠杆菌中表达纯化的AAl2(LG21)蛋白制备多克隆抗体，Western印迹检测抗体的特异性；用自制的抗体在A1-5和B4细胞中进行了免疫共沉淀实验；同时将AAl2与Chkl基因克隆入酵母双杂交载体中，将重组质粒导入酵母菌AH109中，检测报告基因的表达情况。结果：Western印迹结果表明该抗体可以与AAl2蛋白特异结合；并用免疫共沉淀实验验证了从12蛋白与CHKl蛋白在哺乳动物细胞体内的相互作用。同时用酵母双杂交实验验证了AAl2蛋白与CHKl蛋白在酵母体内的相互作用，β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析结果均为阳性。结论：AAl2蛋白和CHKI蛋白之间存在相互作用，此结果为进一步研究新基因AAl2的功能奠定了基础。     

酵母双杂交技术研究与内皮抑制素相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术研究与内皮抑制素(endostatin)发生相互作用的蛋白，有助于阐明其本身抑制血管生成作用的分子机制。方法：应用酵母双杂交系统3，以内皮抑制素为诱饵，筛选人肝cDNA文库，寻找能与之相互作用的蛋白。利用生物信息学技术，一对一酵母回复性杂交，β-GAL实验等提供的信息，筛除假阳性克隆。结果与结论：经过酵母双杂交共获得281个克隆，经过验证，有6个阳性克隆，这些蛋白基因有可能与内皮抑制素的作用过程有关。     

KGF-2与PRO2605蛋白相互作用的初步研究

目的：利用酵母双杂交系统筛选KGF-2的相互作用蛋白，为阐明其分子作用机制提供有益线索。方法：通过聚合酶链反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF-2 cDNA，构建诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2，并对其自身转录激活活性进行鉴定，利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库，挑选双阳性克隆。将KGF-2和候选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中，共同转染COS-7细胞，通过CAT分析验证KGF-2和候选蛋白之间的相互作用。结果：VDNA序列分析和同源检索显示所获候选蛋白为PR02605。以KGF-2和PRO2605 cDNA共转化酵母宿主Y190后可激活报道基因，但共转染COS-7细胞后，CAT分析结果阴性。结论：KGF-2和PRO2605在酵母体内存在相互作用，但在COS-7细胞中未能检测到两者的相互作用。     

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

 目的 通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法 将诱饵质粒pGBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体pCMV - Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull- down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果 诱饵质粒pGBKT7 -LCMR1与95D细胞cDNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载pCMV-Myc-LCMR1、pcDNA3.0-flag-RPL29及pcDNA3.0- flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论 酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。     

应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证。方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1。成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达。免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用。结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证。     

G-CSF受体和EPO受体胞内区蛋白在酵母细胞中的转录激活功能的比较研究

目的 探索应用酵母双杂交系统筛选造血因子受体胞内区结合蛋白的可行性。方法 利用RT-PCR从小鼠NFS-60和BET-2细胞中扩增G-CSF受体和EPO受体胞内区全长序列,并连接至酵母表达载体pGBKT7,转化酵母菌株AH109,提取蛋白进行Western blotting分析,进一步用β-半乳糖苷酶方法检测蛋白转录激活活性。结果 Western blotting结果显示,G-CSF受体和EPO受体在酵母细胞中均可以正常表达。β-半乳糖苷酶检测结果发现,G-CSF受体在酵母细胞中不呈现转录激活功能,然而EPO受体则出现转录激活功能。结论 应用酵母双杂交系统筛选造血因子受体胞内区结合蛋白可适用G-CSF受体研究,但不适用EPO受体,该筛选蛋白的方法并非适用于所有的造血因子受体。     

一种新的抗辐射性相关蛋白AA12和CHK1相互作用研究

目的研究AA12蛋白与CHK1蛋白的相互作用.方法用在大肠杆菌中表达纯化的AA12(LG21)蛋白制备多克隆抗体,Western印迹检测抗体的特异性;用自制的抗体在A1-5和B4细胞中进行了免疫共沉淀实验;同时将AA12与Chk1基因克隆入酵母双杂交载体中,将重组质粒导入酵母菌AH109中,检测报告基因的表达情况.结果Western印迹结果表明该抗体可以与AA12蛋白特异结合;并用免疫共沉淀实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在哺乳动物细胞体内的相互作用.同时用酵母双杂交实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在酵母体内的相互作用,β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析结果均为阳性.结论AA12蛋白和CHK1蛋白之间存在相互作用,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础.     

hPer1相互作用蛋白的筛选

目的 应用酵母双杂交系统筛选血液中与人体生物钟蛋白Per1相互作用的新蛋白.方法 以人Per1的basic HLH-PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选与之相互作用的新蛋白.阳性克隆送测序后用生物信息学分析.结果 酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.通过测序和生物信息学分析,其中之一能与Per1相互作用的蛋白为LSMD1.结论 通过酵母双杂交系统证明Per1能够与LSMD1发生相互作用.     

DNA双链断裂感应分子ATM能与PTC1相互作用

目的：研究DNA双链断裂感应分子ATM与原癌基因ret重排活化蛋白PTC1的相互作用。方法：用Flag抗体Western印迹检测，ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的PTC1；RET抗体检测ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的c-ret;用HA／myc抗体Western印迹检测，HA－ret TK myc-LZPR免疫共沉淀蛋白复合物；荧光蛋白标记的亚细胞定位。结果：PTC1可以与ATM激酶相互作用，此作用不依赖于电离辐射，且不被PI3K家族特异性抑制剂沃氏蓝霉素（wortmannin)所抑制，而野生型RET蛋白则不能同ATM结合；缺失体实验进一步证明两者的结合区段为ATM的LZPR结构域与PTC1的酪氨酸激酶结构域，构建PTC1绿色荧光蛋白表达质粒的亚细胞定位实验显示，PTC1以弥散形式分布于细胞质内。结论：胞浆蛋白PTC1可能借债某种途径使ATM在DNA损伤反应发生后重新定位，介导了细胞的恶性转化机制。     

HLH缺失型Id2候选相互作用蛋白

目的:筛选可以与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域缺失的Id2相互作用的蛋白.方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建 BD∶ Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒;构建MCF-7细胞的ds cDNA文库;采用共转化方法进行Id2-DBM-δHLH相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,采用PCR方法扩增阳性克隆中的AD∶ cDNA序列并测序;将获得的AD∶ cDNA质粒分别与BD∶ Id2-DBM-δHLH诱饵质粒共转化酵母进行配对验证.结果:酵母双杂交方法共筛选到19个阳性克隆,PCR方法在这19个克隆中共扩增到28条片段,序列测定证实含18个不同的基因,对其中的13个进行配对验证后证实了其中8个与HLH缺失型Id2相互作用,这8个基因分别是:UXT、VIM、KRT7、FHL2、SEI1、PCBP1、SIVA和LSM2.结论:本研究首次利用HLH缺失型Id2作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选识别了一族新的Id2相互作用蛋白,为进一步研究Id2的功能调控以及非HLH依赖的功能活性奠定基础.     

ERRα通过抑制TBK1活性抑制干扰素途径

目的本文拟证明TANK结合激酶1（TBK1）与雌激素受体相关受体α（ERRα）的相互作用及ERRα对TBK1活性的影响。方法通过免疫共沉淀（co-IP）方法证明TBK1与ERRα是否可以在体内外形成复合物,然后通过荧光素酶报道基因的方法研究ERRα对β干扰素（IFNβ）信号通路的影响,再用小干扰RNA构建了ERRα敲低稳定细胞系,在该细胞系中进一步检测ERRα对IFNβ信号通路的影响。结果通过内源及外源co-IP发现,TBK1与ERRα可以发生相互作用;另外,ERRα可抑制VSV病毒、polyI∶C及TBK1引起的IFNβ升高,敲低ERRα表达后,IFNβ表达水平增加。结论 TBK1与ERRα在293细胞内可以发生相互作用,ERRα抑制IFNβ途径的激活,为进一步研究ERRα在宿主先天免疫中的作用奠定了基础。     

FHL2与IGFBP-7存在直接相互作用

目的：利用酵母双杂交技术筛选FHL2的相互作用蛋白，为进一步研究FHL2的功能奠定基础。方法：从卵巢文库中钓取FHL2 cDNA，构建诱饵蛋白栽体pAS2-1-FHL2，利用酵母双杂交筛选技术，在卵巢文库中筛选与FHL2相互作用的蛋白。将含有pACT2-候选基因的酵母菌与含有pAS2-1-FHL2的酵母菌进行交配实验，利用LacZ报告基因检测FHL2与候选蛋白之间是否存在相互作用。将FHL2和候选蛋白分别构建到pGEX-KG和pET-28a上，并纯化GST-FHL2和His-候选蛋白融合蛋白，利用GST沉淀实验进一步验证FHL2和候选蛋白的体外相互作用。结果：所获取的候选蛋白为IGFBP-7，是胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）家族中的一员。交配实验表明，IGFBP-7与FHL2能特异性地相互作用，而不与空载体或BRCT1对照相互作用。GST沉淀实验进一步验证，IGFBP-7能与FHL2结合，而不与GST结合。结论：FHL2和IGFBP-7在体内及体外均可发生特异性的相互作用。