基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的:用基因工程方法获取重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础.方法:PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白.结果:成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.结论:获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白.     

人脑胶质瘤特异抗原肽白介素13α2受体的原核表达

目的：构建白介素13α2受体 （Interleukin-13α2 Receptor, IL-13Rα2） 基因的表达质粒, 并检测其在体外原核表达情况,为脑胶质瘤的免疫治疗奠定基础。方法： 用RT-PCR技术从U251胶质瘤细胞株扩增IL-13Rα2基因, 并与克隆质粒pMD19 Sim?ple T载体连接转入DH5α菌克隆, 筛选重组阳性菌落, 用Xho I和Hind Ⅲ将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pET-28a连接, 转入BL21 （DE3） 菌, 提取重组质粒进行酶切及测序鉴定正确后, 在IPTG诱导下原核表达IL-13Rα2抗原肽,并利用镍柱进行纯化回收, SDS-PAGE检测表达蛋白。结果： 成功扩增出IL-13Rα2基因序列, 大小为1 142 bp, 并表达纯化出IL-13Rα2抗原肽, 大小为60 kD, 于诱导第3 h表达量最高, 以包涵体形式表达。结论： IL-13Rα2基因表达质粒能在体外成功构建, 并能在IPTG诱导下成功表达及纯化得到IL-13Rα2抗原肽。     

肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体的构建及蛋白表达

背景与目的肺癌细胞对化疗药物的耐受是肺癌患者生存率低的重要原因之一。我们在前期研究中发现了一条肺腺癌耐药相关的基因BC006151,本研究拟构建肺腺癌耐药相关基因的原核表达载体PGEX-4T-1-BC006151,诱导其表达及鉴定目的蛋白,从而揭示该基因与肺腺癌耐药的关系。方法以RNA为模板RT-PCR扩增,产物与质粒PGEX-4T-1用BamHI和EcoRI双酶切,用T4DNA连接酶将二者连接,连接物转化DH5α菌,重组克隆菌经测序鉴定确认。将带有目的片段的重组克隆载体转化BL21表达菌,SDS-PAGE电泳检测表达产物,Western blot检测GST融合蛋白表达。结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片段,与GenBank中公布的BC006151基因序列一致。重组克隆载体经BL21表达菌表达,获得40KD的条带(其中目的蛋白13KD,GST标签26KD)。结论成功构建了肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体,并成功诱导了目的蛋白表达,GST亲和纯化,为进一步制备该基因的多克隆、单克隆抗体奠定了基础。     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的：用基因工程方法获取重组人血小板因子4（rhPF4）,为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础。方法：PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET—PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS—PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白。结果：成功构建了表达载体pRSET—PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致。IPTG诱导表达的rh—PF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11％。亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84％。结论：获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白。     

人ENO1(Enolase-α)基因的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人ENO1(human Enolase-α)基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白的表达,利用纯化后的蛋白制备具有活性的ENO1多克隆抗体.方法:用PCR方法从胃癌MKN45细胞全基因组中扩增出目的基因ENO1,将目的基因和原核表达载体pET30a(+)分别双酶切,回收酶切产物并用T4连接酶连接,获得重组质粒pET30a(+)-ENO1.将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,利用纯化的ENO1活性蛋白作为抗原免疫家兔,制备抗血清多克隆抗体,并用Western blot检测其特异性.结果:目的基因与原核表达载体经双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果表明重组人ENO1基因序列与NCBI(NM_001428.3)公布序列一致.经SDS-PAGE分析,结果显示重组蛋白的分子量约在47kDa,条带单一,无杂带出现,主要以可溶性形式存在.Western blot证实多克隆抗体制备成功.结论:成功表达、纯化了ENO1融合蛋白,制备了具有高特异性的多克隆抗体,为进一步肿瘤疫苗的研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础.     

MBP-hmcm6融合蛋白的构建与表达

目的构建含微小染色体维持蛋白MBP-hmcm6的原核表达重组质粒,并进行可溶性表达与初步纯化.方法以常规克隆方法将目的片段连接至pMAL-p2x载体,获得的阳性克隆转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达.结果经Western blot鉴定,获得了分子量大小为139 KD的MBP-hMCM6p蛋白.结论成功构建了pMAL-p2x-hmcm6重组质粒和工程菌,实现了重组蛋白可溶性表达,有助于进一步研究MCM蛋白的结构与功能.     

癌-睾丸抗原GAGE-1基因的重组、表达及纯化

目的 为进一步研究临床应用癌-睾丸抗原GAGE-1诱导特异性抗肿瘤免疫反应,对GAGE-1基因进行克隆、体外原核重组表达及蛋白分离纯化。方法 运用RT-PCR技术从人QGY-7701肝癌细胞株中扩增GAGE-1基因片段,插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAGE-1,并导入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达;经包涵体透析复性及GST柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析鉴定。结果 扩增得到GAGE-1基因5’端251 bp片段,与GeneBank公布的序列一致,构建的PGEX-6p-1-GAGE-1原核表达质粒经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达分子量约35.7 kD的GST-GAGE-1融合蛋白,纯化后蛋白纯度为90%以上。结论 成功构建PGEX-6p-1-GAGE-1重组表达质粒,并成功表达纯化了GST-GAGE-1融合蛋白,为进一步深入研究GAGE蛋白奠定了基础。     

scTRAIL在E.coli中的重组表达及抗肿瘤活性的研究

目的:重组表达人单链TRAIL（single-chain TRAIL,scTRAIL）及研究其在抗肿瘤中的作用。方法:通过重组PCR获得编码scTRAIL的基因序列,构建含编码scTRAIL基因的重组质粒,将重组表达质粒转化到大肠埃希菌(E.coli)BL21（DE3）,通过IPTG诱导,破碎细菌,上清行Amylose Resin亲和层析初步纯化融合蛋白。通过MTT法检测融合蛋白对人胰腺胆管上皮细胞SW1990、人大细胞肺癌NCI-H460和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖抑制作用。结果:成功构建并克隆编码scTRAIL的基因序列,经IPTG诱导表达,表达产物的表达量约占菌体蛋白的20%左右,获得了相对分子质量约为110 kD的可溶性重组蛋白MBP-scTRAIL。MBP-scTRAIL分别作用于NCI-H460和SW1990,其增殖抑制作用IC50分别约为111 ng/ml和250 ng/ml,且MBP-scTRAIL增殖抑制率明显高于TRAIL114-281（P<0.01）。结论:scTRAIL的抗肿瘤效果优于单体TRAIL114-281,是一种安全、有效的抗肿瘤生物制品。     

肿瘤-睾丸抗原LAGE-1基因的原核表达纯化和抗血清制备

目的:构建人肿瘤-睾丸抗原LAGE-1的原核表达质粒,表达、纯化LAGE-1融合蛋白并制备GST-LAGE-1多克隆抗体。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增人肝癌组织LAGE-1基因3′端片段,连入原核表达载体pGEX-4T-1( ),构建原核表达质粒pGEX-LAGE-1并测序。将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,经包涵体透析复性和谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统分离纯化目的蛋白。用纯化的融合蛋白GST-LAGE-1免疫新西兰大白兔,间接ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并采用Western blot检测GST-LAGE-1多克隆抗体特异性。结果:RT-PCR扩增得到LAGE-1基因3′端264bp片段,测序结果与GenBank公布序列一致;成功构建pGEX-LAGE-1原核表达质粒,含有该质粒的大肠埃希菌经IPTG诱导后表达相对分子质量约为36×103的蛋白,经包涵体复性和GST融合蛋白纯化系统纯化,得到重组蛋白GST-LAGE-1,纯度达90%;制备兔抗GST-LAGE-1抗体,纯化的抗体经Western blot证实可与目的蛋白特异性结合。结论:获得了纯化的肿瘤-睾丸抗原LAGE-1重组蛋白及其特异性多克隆抗体,为进一步研究LAGE-1抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础。     

LRP16融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的观察和鉴定LRP16在大肠杆菌中的表达,并分离、纯化其蛋白产物。方法应用DNA重组技术,用RT-PCR方法从正常人血液中扩增出LRP16基因全长及其抗原表位区,构建重组表达质粒pRSET-C-LRP16,IPTG诱导表达并纯化融合蛋白采用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。结果成功构建LRP16基因融合蛋白载体,SDS-PAGE显示pRSET-C-LRP16表达于原核细胞,蛋白经电泳分离,切胶后获得纯化的LRP16蛋白。结论制备的高纯度的LRP16蛋白,可在大肠杆菌中稳定表达。     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N¹乙酰基转移酶（SSAT）的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备。方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化。用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测。结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆菌中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高。结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体。     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的基因构建及表达

目的　构建抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0并在大肠杆菌中表达。方法　从质粒pVC85中克隆出PE4 0基因 ,与抗胶质瘤单链抗体SZ39 ScFv基因进行拼接 ,构建出重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0基因 ,并将其克隆于表达载体pET2 0b( ) ,在大肠杆菌Bl2 1(DE3)pLysS中以IPTG诱导表达。结果　SDS PAGE分析显示表达产物主要以包涵体的形式存在 ,分子量为 6 8kD左右 ,与SZ39(ScFv) PE4 0的分子量理论推算值相符 ;Westernblot显示在 6 8kD处出现特异性显色印迹 ;凝胶灰度扫描显示其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。结论　重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0可经原核表达载体 ,pET2 0b( )在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中以包涵体形式得到较高效率的表达。     

新基因NBEAL1的克隆、表达、纯化及其与胶质瘤病理分级的相关性

目的：构建新基因neurobeachin like 1（NBEAL1）的表达载体,研究NBEAL1 的表达与胶质瘤病理分级的相关性。方法：提取人脑胶质瘤细胞U251的总RNA,构建pGEX-KG/NBEAL1表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导NBEAL1重组蛋白的表达,GST亲和纯化,Western blotting鉴定重组蛋白的纯度;以免疫组化法用纯化蛋白制备的单克隆抗体分析NBEAL1表达与胶质瘤病理分级的相关性。结果：NBEAL1基因片段被成功地克隆入pGEXKG表达载体,测序证实克隆片段序列正确。NBEAL1融合蛋白在大肠杆菌BL21包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度95%以上。Western blotting证明所纯化的蛋白含有GST标签与NBEAL1肽段。免疫组化法检测显示NBEAL1蛋白的表达在正常脑组织中较低,而在低级别的脑胶质瘤组织中表达明显上调,但随着恶性程度增加NBEAL1的表达程度降低,两者呈负相关。结论：成功地克隆、表达及纯化NBEAL1蛋白,NBEAL1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达与其恶性程度呈负相关。     

抗人KIAAO100蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备抗人KIAA0100蛋白多克隆抗体,为今后研究人KIAA0100蛋白的结构和功能奠定基础.方法:采用生物信息学软件对人KIAA0100蛋白第1 557～2 234位氨基酸序列进行原核密码子优化,将优化后的核苷酸序列经人工合成后克隆入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒;采用限制性酶切分析对重组质粒进行鉴定;将正确的重组质粒转化人大肠杆菌BL21(DE3)细胞,以表达羧基末端携带6×组氨酸标签的重组蛋白;使用重组蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗人KIAA0100蛋白多克隆抗体;使用蛋白质印迹分析检测该多克隆抗体对人KIAA0100蛋白的识别能力.结果:限制性酶切分析显示:重组质粒被成功构建;SDS-PAGE分析结果显示:主要以包涵体形式存在的重组蛋白被成功表达;蛋白质印迹分析证实:该多克隆抗体能够高效地识别人KIAA0100蛋白.结论:成功制备了抗人KIAA0100蛋白多克隆抗体,以上研究结果为我们将来研究人KIAA0100蛋白的结构和功能奠定了基础.     

新型人上皮性卵巢癌细胞HO8910靶向输送系统的构建及其生物学活性的鉴定

目的 构建新型人卵巢癌HO8910细胞株靶向输送系统TAT-OSBP-EGFP,并对其靶向输送特性和体外活性进行研究鉴定。方法 采用PGEX-6P-3质粒分别构建TAT-OSBP、OSBP-EGFP和TAT-OSBP-EGFP表达载体,重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌,经IPTG诱导表达和GST SefinoseTM Resin柱亲和层析纯化后,采用SDS PAGE 和Western blotting 鉴定。流式细胞术分析不同浓度（0、1、5、10μmol/L）TAT-OSBP、OSBP-EGFP和TAT-OSBP-EGFP融合蛋白处理HO8910细胞2h后的细胞穿膜率,细胞免疫荧光法检测3种融合蛋白对HO8910的输送特性（以人结肠癌LoVo细胞作对比）,CCK-8法检测0、1、5、10、15、40、60、80、100μmol/L TAT-OSBP-EGFP处理HO8910细胞2h后的细胞活性。结果 成功构建TAT-OSBP-EGFP原核表达载体,并获得可溶性融合蛋白。与TAT-OSBP相比,当浓度为10μmol/L时,TAT-OSBP-EGFP处理后HO8910细胞的穿膜率无明显升高（P＞0.05）;但当浓度为1、5μmol/L时,TAT-OSBP-EGFP处理后HO8910细胞的穿膜率升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。经TAT-OSBP-EGFP蛋白处理,HO8910细胞内荧光强度高于LoVo细胞;经TAT-OSBP蛋白处理,HO8910细胞内绿色荧光强度与LoVo细胞相似;经OSBP-EGFP蛋白处理,两种细胞内未见明显的绿色荧光。不同浓度TAT-OSBP-EGEP对HO8910细胞活性无影响（P＞0.05）。结论 成功构建针对人卵巢癌HO8910细胞株的靶向输送系统,为下一步肿瘤靶向药物输送载体的构建并发挥肿瘤的靶向杀灭作用打下了良好的基础。     

GST-P12融合蛋白的抗体制备、鉴定及免疫组化分析

目的：为了进一步研究p12DOC-1基因及其蛋白在口腔癌发生中的作用与调控机制,将已表达纯化好的GST-p12融合蛋白进行多克隆抗体的制备及鉴定.方法：将构建好的融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1转化BL21（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,得到GST-p12融合蛋白,经亲和层析柱纯化后电泳,再割胶研磨作为抗原直接免疫家兔,经Western blot及ELISA检测抗体效价及特异性并做免疫组化分析.结果：得到较高纯度的GST-p12融合蛋白,获得了兔来源的抗p12DOC-1血清,经蛋白免疫印迹杂交反应及免疫组化分析证实所得的抗体具有较高的特异性和效价.结论：成功制备了兔抗人的p12DOC-1抗血清,为进一步研究p12DOC-1在口腔癌中发生缺失的机理打下基础.     

Antibody against biologically active p40 subunit of porcine interleukin-12 expressed in Escherichia coli

A truncated p40 subunit of porcine interleukin-12 (pIL-12) gene without the N-terminal signal peptide sequence was amplified by PCR and cloned into prokaryotic expression vector pGEX-6P-1. The resulting recombinant plasmid pGEX-IL12-40 was transformed into host cells BL21(DE3)pLysS, and the expression of the p40 subunit was induced using isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG). An anti-p40 polyclonal antibody was generated by immunizing a rabbit with the purified protein. Immunoreactivities of the p40 protein and the antibody were confirmed by immunoblotting. At the same time, a recombinant plasmid expressing the entire pIL-12 consisting of p35 and p40 genes was constructed by splicing by overlap extension (SOE)-PCR and transiently transfected into BHK-21 cells. Expression of p40 subunit on the surface of the transfected cells was identified using the anti-p40 antibody. The p40 protein and the specific antibody are biologically active and can be used as detecting reagents.     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。