原代人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的 :观察对原代人视网膜色素上皮 (retinalpig mentepithelium ,RPE )细胞进行冻存和复苏培养的效果 .方法 :将 6只尸供眼 ,常规酶消化法分离、纯化的人原代RPE细胞 ,分为两组 ,实验组为即刻进行常规梯度降温液氮冷冻保存 ,1wk后行常规复苏培养 ;对照组为细胞直接进行后续实验 .台盼蓝拒染观察细胞存活率及生长状态 ;计算细胞贴壁率 ;初步计算克隆形成率 .结果 :RPE细胞存活率分别为试验组 (90± 7) % ,对照组 (87± 1 5 ) % ,两组相比无显著性差异(P >0 .0 5 ) ;两组接种细胞贴壁率从 2 4h开始分别为 (5 .0±3.1 ) %～ (6 1 .0± 7.3) %和 (1 5 .0± 6 .3) %～ (6 0 .0± 3.3) % ;培养 4 8h之前 ,两组之间存在统计学差异 (P <0 .0 5 ) ,4 8h之后组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 5 ,7和 1 0d初步克隆形成率两组分别为 (1± 0 ) % ,(1± 1 ) % ,(3± 1 ) %和 (1±0 ) % ,(3± 1 ) % ,(2± 1 ) % ,组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ,n=3) .冻存后复苏培养的RPE细胞生长状态良好 ,增生活跃 ,与对照组类似 .结论 :对原代人RPE细胞进行冻存 ,复苏培养的RPE细胞活性、存活能力、单细胞分裂增生能力不受影响 .     

舒拉明对培养的人视网膜色素上皮细胞移行的影响

目的 观察舒拉明（suramin)对培养的人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium,RPE)移行的影响。方法 在体外培养的RPE细胞的损伤模型中,加入不同浓度的舒拉明（1.5,15,150mg/L)观察12h,24h和48h3个时间点RPE细胞移行率。结果 无血清培养液中的RPE细胞有较弱的移行能力,含有100ml/L新生小牛血清的培养液可以显著刺激RPE细胞移行（P＜0．01）,3种浓度舒拉明可以显著抑制100ml/L血清条件下的RPE细胞的移行,12h移行率分别对照组的82％、74％和46％、24h为92％,83％和52％、48h为92％,84％和55％这种作用呈剂量依赖性。结论 血清中的某些成分可以刺激RPE细胞的移行,舒拉明可以抑制血清的这种作用,为临床预防和治疗增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR)提供了新的用药思路。     

不同光照时长对体外培养人视网膜色素上皮细胞光损伤凋亡的影响

目的 研究不同光照时长对体外培养的人视网膜色素上皮细胞（hRPE）凋亡的影响,筛选出最佳建造光损伤模型的光照时长,为后续研究视网膜光损伤机制及光损伤保护提供必要的实验基础.方法 体外培养人视网膜色素上皮细胞（h RPE）,用三基色冷光灯模拟自然光源,选取（2500 ±500） Lux作为基础光照强度,以不同光照时长（2、4、6h）对细胞进行照射,建立光损伤模型.分别采用MTS法和流式细胞术检测细胞活力及早期凋亡率,比较给予不同光照时长后,hRPE的活力及早期凋亡率的差异.结果 与空白对照组比较,不同光照时长（2、4、6h）均能抑制细胞活力及引起细胞凋亡;光照时间越长,细胞损伤越严重,光照6h组细胞活力下降明显（P＜0.05）;光照组细胞早期凋亡率较空白对照组升高（P＜0.05）,光照组间比较,光照4h组早期凋亡率升高明显（P＜0.05）.结论 不同光照时长均可造成hRPE不同程度的损害;给予4h时长光照后,hRPE损伤以早期凋亡为主,同时又保有较高的细胞活力,故选取4h作为最佳建造光损伤模型的光照时长.     

体外培养人胚胎肝上皮细胞方法探讨

采用组织块培养法培养的人胚胎肝上皮细胞于培养后第３－９天即在贴壁组织块周围长出，并可在体外较长期进行培养；传至第８代时仍能分泌甲胎蛋白（ＡＦＰ），含量为１５－４０μｇ／Ｌ。组织块培养法不失为一种较为简单、实用、经济和有效的方法，为探索人胚细胞体外培养方法提供了参考、借鉴的途径。实验还发现人胚胎肝新生细胞长出与组织块贴壁率密切相关。     

人视网膜色素上皮细胞原代培养及HGF/c-Met的表达

目的：探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)及其受体c-Met在原代培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞中的表达情况。方法：体外培养人RPE细胞，3—5代细胞用于实验；采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测细胞内HGF及其受体c-Met的表达。结果：人RPE细胞HGF及其受体c-Met免疫细胞化学染色的阳性信号分别位于细胞浆内和细胞膜上；RT-PCR方法可检测到HGF及其受体c-Met mRNA的表达。结论：人RPE细胞自身产生HGF并表达其受体c-Met，提示HGF可能通过自分泌和(或)旁分泌途径作用于RPE细胞，涉及眼内多种疾病过程。     

人晶状体上皮细胞体外培养

白内障囊外摘除术后的远期并发症主要是后囊混浊 ,是导致视力下降的主要原因 ,其发生率可达50 %。现已明确后囊混浊发生的主要原因是由于残留的晶状体上皮细胞增生 ,并向后迁移所致。因此 ,抑制晶状体上皮细胞的增生 ,对于减少后囊混浊的发生十分重要。筛选有效的适合于临床应用的药物 ,需要在体外培养晶状体上皮细胞进行。由于晶状体材料组织块小 ,且无色透明 ,上皮细胞的体外培养具有一定的难度。为此 ,作者进行人晶状体上皮细胞体外培养实验 ,并对材料的处理和细胞培养条件进行了探讨。1　材料和方法1.1　材料 :人晶状体上皮细胞取材于年…     

人胚胎骨髓间充质干细胞的体外培养

目的 摸索体外培养人胚胎骨髓间充质干细胞的方法.方法 采用含5%胎牛血清的MEM(modified Eagle's medium)培养基培养人胚胎骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测培养获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量.结果 培养获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达93%.结论 本研究方法培养获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高,细胞活性好.     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养

目的：将猪视网膜色素上皮(RPE)细胞进行体外培养，为研究RPE细胞的功能及治疗有关眼底疾病提供细胞来源。方法：采用胰酶2次消化法分离猪RPE细胞，15％DMEM培养液培养，每天倒置显微镜观察细胞生长情况，并作流式细胞仪分析培养细胞的细胞周期。以免疫组织化学法鉴定培养细胞的来源。结果：离体培养细胞初期呈圆形，富含黑色素，12～24h贴壁呈圆形、梭形及不规则形。传代后细胞渐趋透明。免疫组化证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。细胞周期分析提示体外培养的RPE细胞保持正常的繁殖能力。结论：培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源。     

自发和诱导分化产生的人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮补体H因子的表达

  目的  研究人胚胎干细胞（hESC）分别经自发分化和诱导分化产生的视网膜色素上皮细胞（RPE）表达及分泌补体替代通路调控蛋白补体H因子（CFH）的情况。  方法  将hESC分别按照临床试验中所采用的自发分化法和利用生长因子与小分子药物诱导分化的方法获得hESC-RPE,在第3代hESC-RPE培养至第4~5周后,采用实时荧光定量PCR和免疫荧光进行鉴定,酶联免疫吸附（ELISA）法检测CFH的分泌水平。对照组为ARPE-19细胞系。  结果  hESC通过自发分化和诱导分化均可获得在细胞形态及特异性基因表达方面与人原代RPE高度相似的细胞。自发分化产生的视网膜色素上皮细胞（sdRPE）和诱导分化产生的视网膜色素上皮细胞（iRPE）的CFH mRNA相对表达量均高于对照组ARPE-19细胞系（P<0.05）。在24 h、48 h和72 h的条件培养基中,sdRPE组的CFH分泌量高于iRPE组（P=0.000 2）,且sdRPE和iRPE均高于ARPE-19细胞系（P<0.000 1）。  结论  两种分化方式来源的hESC-RPE均可表达并分泌CFH,提示hESC-RPE可能具有一定的调控补体替代通路的能力。     

Gene expression profile changes caused by the dysfunction of Mer during retinal pigment epithelium phagocytosis

Background  Studies indicated that Mer might be the main contributor to the specific internalization of photoreceptor outer segments (POS) in retinal pigment epithelium (RPE). It is very important to understand the mechanism of POS phagocytosis under the pathway of Mer and its ligands. The objective of this study was to identify changes in gene expression profiles caused by Mer gene knockout (Mer-/-) during phagocytosis of POS in RPE.

Methods  RPE from both Mer-/- and wild-type (WT) mice were isolated and cultured to the 3rd passage. POS were subjected to culture medium with 20 nmol/L Gas6 and protein S to activate specific mer-mediated phagocytosis. RPE phagocytosis was evaluated by phagocytosis assays and differential gene expression identified by microarray at 3 and 12 hours; the 0-hour time point served as the control. Three independent samples for each Mer-/- or WT RPE were subjected to the same protocol of microarray. Five genes were confirmed by real-time quantitative PCR (QPCR).

Results  The Mer-/- RPE had less internalized POS than WT RPE after both 3 and 12 hours in phagocytosis assay. Compared to WT RPE and the 0-hour control, 38 and 45 different known genes were increased and 68 and 59 known genes were decreased in Mer-/- RPE after 3 and 12 hours, respectively. Abnormal POS phagocytosis in Mer-/- RPE was associated with significant gene expression changes in, for example, signal transduction (WNT, MAPK), phagocytosis (Vav3, Hsd11b1), cytoskeleton components (Myo7a), and metabolism, in a time-specific manner. QPCR results showed Vav3, Hsd11b1, Myo7a, Rtn2 and Itga8 in those independent samples were consistent with microarray.

Conclusion  Gene expression profiles modulated in a time-specific manner in Mer-/- RPE indicate a possible internalization mechanism for abnormal POS phagocytosis, which gives insight into the mechanism of retinitis pigmentosa caused by the mutation of MerTK in humans.

     

Mer-/-视网膜色素上皮细胞在吞噬光感受器外节盘膜中的基因表达谱的改变

目的： 研究在视网膜色素上皮细胞（RPE）吞噬光感受器外节盘膜（POS）时,由于RPE的Mer基因敲出（Mer-/-）后,所导致的基因表达谱的改变。 方法： 将RPE从Mer-/-小鼠（实验组）和野生型小鼠（对照组）中分离出后,并培养至第3代。在实验组和对照组中,将提取的POS加入含有20nMGas6和Protein S的培养液中,以激活Mer受体通道所介导的RPE特异性吞噬POS。在刺激吞噬后3小时和12小时终止实验,在两组中分别通过显微镜评价RPE吞噬POS的能力,通过基因表达谱芯片筛选出差异表达的基因。并且,在相同的实验条件下,在实验组和对照组中,分别重复3次吞噬实验,采用QPCR,对于其中5个差异表达的基因进行确认。 结果： 显微镜下观察到不论在3小时还是12小时,与对照组相比,实验组中内吞的POS颗粒少。在基因表达谱芯片中发现,反应3小时和反应12小时,实验组中分别有38个和45个已知基因上调,68个和59个已知基因下调。与对照组相比,实验组中RPE内吞POS能力的下降与基因表达谱中差异表达的基因相一致,比如,发现信号转导（WNT,MAPK）、吞噬（Vav3, Hsd11b1）、细胞骨架成份（Myo7a）和代谢等方面相关的基因在不同的时间点均有不同的表达谱改变。QPCR结果发现Vav3、Hsd11b1、Myo7a、Rtn2等基因的表达变化与基因芯片结果相一致。 结论： Mer-/-基因敲出后的RPE在吞噬过程中随时间变化而出现的不同的基因表达谱的改变,给研究Mer受体通道介导的RPE吞噬POS的分子机制提供了新的研究方向和线索,特别有利于MerTK基因突变所致的人类视网膜色素变性患者发病机制的研究。     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

兔视网膜色素上皮细胞培养和鉴定

目的：进行兔视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的体外培养，探讨RPE培养与鉴定方法，为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。方法：用改良的眼杯固定法，将其固定在眼球托上，用胰酶直接消化视网膜色素上皮面，收取RPE细胞。作细胞形态学、免疫组织化学、免疫荧光鉴定。结果：RPE细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒，多巴氧化酶呈阳性反应．免疫组织化学染色和免疫荧光染色提示角蛋白表达强阳性。结论：培养的大量细胞可用于RPE的体外实验研究，多巴染色是鉴定RPE细胞一种较好的方法。     

血小板源性生长因子对人视网膜色素上皮细胞的作用

目的　观察血小板源性生长因子 (PDGF)对人视网膜色素上皮细胞 (hRPE)增殖和移行能力的影响 .方法　将体外培养的第 46代人视网膜色素上皮细胞分为DMEM组(改良型Eagle培养液 )和含有 2 0mL·L-1小牛血清的DMEM组(2 0 g·L-1DMEM ) ,每组分别加入不同浓度 (0 .1,1,5 ,10 ,5 0和 10 0 μg·L-1)的PDGF ,然后采用MTT比色法观察分析其对hRPE的增殖作用 ;应用hRPE损伤模型 ,计数进入缺损区的细胞 ,定量观察PDGF对hRPE移行的影响 .结果　①增殖作用 :0 .110 0 μg·L-1的PDGF均能促进hRPE的增殖 ,DMEM组 10 μg·L-1时促增殖作用最明显 ,增殖率达15 3% ;2 0 g·L-1DMEM组 5 0 10 0 μg·L-1的增殖率为 174% ,作用最强 .②移行作用 :PDGF能够显著促进hRPE的移行 ,并呈剂量依赖性 ,5 0 10 0 μg·L-1时促移行能力最强 ,DMEM组移行率为 5 10 % ,2 0mL·L-1FBS +DMEM组达 6 40 % .结论　PDGF能够促进hRPE的增殖和移行 ,有血清时可以加强这种作用 ,提示它在PVR的发病过程中可能发挥了重要作用     

人参皂苷Rg3对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的 研究人参皂苷Rg3(Ginsenoside-Rg3)对体外培养视网膜色素上皮(RPE)细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法 通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度(10、20、50、80、100、150mg/L)Rg3和Rg3 80mg/L在不同作用时间(6-120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果 Rg3组细胞增殖受到抑制并出现细胞脱落，Rg3 100mg/L具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，96h达高峰。Rg3组A值明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论 Rg3可能通过抑制钙内流促进钾外流改变细胞膜电位、干扰RPE细胞代谢，对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。     

人参皂甙Rb2对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的：研究人参皂甙Rb2(Ginsenoside-Rb2)对体外培养视网膜色素上皮细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法：通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度（250、200、120、100、50、10μg/ml）Rb2t Rb2 150μg/ml在不同作用时间（6－120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果：Rb2组细胞增殖受到抑制并出现细胞脱落，Rb2 200μg/ml具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，96h达高峰。Rb2组A值明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论：Rb2可能通过阻滞钙通道降低细胞内钙浓度、干扰RPE细胞代谢对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。     

人视网膜色素上皮细胞培养方法的改进

目的:建立一种简单有效的人视网膜色素上皮细胞培养的改进方法。方法:先采用机械分离法将晶状体、玻璃体及视网膜神经上皮层剥离干净,去除前眼杯,然后用胰蛋白酶消化后眼杯,后再用机械分离法分离RPE层,将分离下的RPE层分散置入培养瓶中。结果:组织块1d后贴壁,7d后可见有黑色、圆形的RPE细胞缓慢爬出,10d后细胞变成扁平不规则多角形,约13d后细胞基本单层融合长满瓶底,形成典型的鹅卵石样。传代细胞生长活跃5～6d后达融合状态,细胞呈梭形及不规则形。Keratin免疫组化鉴定显示,所获细胞的纯度接近100%。结论:用此改良的方法,可以有效提高RPE细胞培养的数量和纯度。     

Caspase-3在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡中作用

目的　探讨天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(caspase)成员 caspase- 3在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮 (RPE)细胞凋亡中的变化 .方法　原代培养的人 RPE细胞经 2 0 0μg· L- 1 柔红霉素诱导 8,2 4和 36 h后 ,按照 caspase- 3荧光检测试剂盒说明处理细胞 ,再通过荧光比色法间接检测细胞碎片中 caspase- 3的活性 .结果　正常 caspase- 3的活性为(0 .0 94± 0 .0 0 5 ) nmol AFC,8h后增加为 (0 .44 6± 0 .0 2 9)nm ol AFC,2 4h后为 (0 .75 4± 0 .0 5 6 ) nmol AFC,36 h又下降到 (0 .486± 0 .0 33) nmol AFC,但都高于正常水平 (P<0 .0 1) .加入特异性四肽抑制物 DEVD- CHO1μL 后活性为 (0 .0 40±0 .0 0 3) nm ol AFC,显著低于正常 (P<0 .0 1) .结论　 Caspase-3参与了柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞的凋亡 ,柔红霉素可使其活性增加 .     

全反式维甲酸对人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的：研究全反式维甲酸（ATRA）对体外培养人视网膜色素上皮（RPE）细胞增生的抑制作用及机制。 方法：采用传代培养的人RPE细胞,分成不同浓度（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6和10^-5 mol•L ^-1的ATRA）和不同时间点（6、12、24、48、72和96 h）给药组,通过活细胞计数法、MTT比色法和流式细胞术分别检测ATRA对人RPE细胞增生的影响。 结果：ATRA给药组细胞生存率低于非给药组（P<0.01）。细胞增生的抑制率与药物剂量及时间呈正相关 (r₁=0.9926,P<0.05; r₂=0.9647,P<0.05)。与非给药组比较,ATRA给药组 RPE细胞周期中G₁期细胞增加（P<0.05),而G₀/G₁期细胞数明显减少(P<0.05）。结论：ATRA可能通过阻滞人RPE细胞周期对RPE细胞增生具有剂量依赖和时间依赖的抑制作用。