人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。     

人白介素1受体拮抗剂的cDNA克隆和原核表达

从活化的正常人外周血单核细胞中提取总ＲＮＡ，经逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获得了人白介素１受体拮抗剂（ＩＬ－１Ｒａ）ｃＤＮＡ。经过ＤＮＡ测序分析，发现该片段和国外发表的ＩＬ－１ＲａｃＤＮＡ序列一致，将该目的基因插入ｐＢＶ２２０载体，并转入大肠杆菌ＨＢ１０１中，经热诱导表达重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后发现，菌体超声裂解后，在可溶性上清中有一Ｍ１７０００的特异带，约占菌体可溶性总蛋白的８０％以上     

hIL-15成熟肽段基因的克隆及其原核表达载体的构建

本文采用ＲＴ ＰＣＲ的方法自成人脾脏中扩增出ｈＩＬ １５成熟肽段基因，定向克隆入ｐＵＣ１９中，筛选带有插段的阳性克隆。经序列测定证实后，插入大肠杆菌融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ １中，构建重组表达质粒ｐＧＩＬ １５。ＳＤＳ ＰＡＧＥ证实ｐＧＩＬ １５大肠杆菌中可表达分子量为３８６ｋＤ的融合蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的１８５％。目的蛋白经纯化后具有促进靶细胞ＤＮＡ合成的作用。     

人MBL相关丝氨酸蛋白酶-1 cDNA的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＬ）相关丝氨酸蛋白酶－１（ＭＡＳＰ－１）基因。方法 以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ获取目的ｃＤＮＡ片段,克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体,进行酶切图谱分析和测序鉴定。结果 以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了含信号顺序的全长ＭＡＳＰ－１ｃＤＮＡ,将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,建立了ＭＡＳＰ－１的ｃＤＮＡ克隆,酶切图谱与微机分析结果一致。序列分析表明。与     

EphB2配体结合域基因片段的高效表达

目的;对酷氨酸蛋白激酶受体ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因进行表达研究。方法：编码ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因片段克隆于ｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）质粒中,经全自动序列分析仪测正确后,再克隆重组人表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１,构高效表达克隆ｐＨＴ。转化大肠杆菌ＤＨ５α表达。结果：经ＩＰＴＧ诱导５ｈ,蛋白表达即达高峰,ＳＤＳ ＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析,表达出约４１ＫＤ大小的蛋白,占菌体总蛋白的３５％     

人白细胞介素15cDNA克隆及其在大肠杆菌中表达

从ＬＰＳ活化的人外周血单核细胞总ＲＮＡ中，用ＲＴＰＣＲ方法扩增出编码成熟人白细胞介素１５（ｈＩＬ１５）的ｃＤＮＡ，并将其克隆于ｐＢｌｕｅＳｋｍ质粒中，序列测定结果与预期一致。再将ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ克隆于表达载体ｐＢＶ２２０，构建了高效表达克隆ｐＢＶＩＬ１５。热诱导４ｈ，ｈＩＬ１５蛋白表达即达高峰。表达的重组蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析，分子量约１３ｋＤ，占菌体总蛋白的３３％，经包涵体提取及ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤纯化，重组蛋白纯度达９５％以上，具有显著的促鼠Ｔ淋巴母细胞增殖作用     

人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义

目的：为探讨肿瘤细胞ｗｔ ｐ５３蛋白功能失活机制的研究,检测肿瘤患者血清抗ｐ５３抗体辅助临床诊断提供人ｗｔ ｐ５３蛋白。方法 将人ｗｔ ｐ５３基因ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＱＥ－３０中,得到重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｐ５３,用ｐＱＥ３０－ｐ５３重组质粒转化大肠杆菌Ｍ１５细胞,转化菌落经ＰＣＲ扩增和ＢａｍＨⅠ、Ｘｂａ Ｉ酶切证实ｐ５３基因插入。ＩＰＴＧ诱导大肠杆菌表达ｗｔ ｐ５３蛋白,通过Ｎ     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

小鼠白细胞介素6的cDNA克隆及其在昆虫细胞中的表达

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＬＰＳ刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，扩增小鼠ＩＬ－６ｃＤＮＡ，并克隆构建ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）ＩＬ－６质粒，继将小鼠所得ｃＤＮＡ克隆到ｐＶＬ１３９２载体上，利用杆状病毒ＡｃＮＰＶ表达系统在Ｓｆ９中进行瞬间表达，用ＩＬ－６依赖细胞株ＭＨ６０·ＢＳＦ２检测其表达活性，结果表明，感染后４８ｈ后就具有明显ＩＬ－６表达，由此可见，利用该系统可成功地表达小鼠ＩＬ－６基因。     

人PBMC中IL—18基因的克隆及在E.coli中的高效表达与纯化

从一名丙型肝炎病人的外周血单个核细胞分别克隆了前体和成熟人白细胞介素－１８的基因,并应用大肠杆菌表达系统,成功地表达了重组ｈＩＬ－１８的前体和成熟蛋白,从人ＰＢＭＣ中提取总ＲＮＡ,用ｐｌｙ（Ｔ）８－１２反转录成ｃＤＮＡ,再以ＰＣＲ扩增出特异ＤＮＡ片段。利用Ｅ．ｃｏｌｉ表达载体ｐＱＥ－３０,构建分别表达ｈＩＬ－１８前体和成熟蛋白的重组质粒ｐＱＥＩＬ１８ｐ和ｐＱＥＩＬ１８ｍ,转化Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５后,     

利用GeneHub软件多角度分析基因功能相关与表达相关的联系

我们研制的GeneHub软件可以用来评价基因功能分类体系中各个功能单元的表达相关性的显著性，从而筛选与实验条件相关的功能单元。采用不同的相似性测度与不同的数据集，使用GeneHub研究了分别按染色体定位、蛋白质细胞位置与互作、代谢通路、信号传导通路等五个方面分类的基因的表达相关性，结果显示按照这些不同的方面分类的基因显著共表达，并且这种共表达现象往往受相关实验条件影响。为基因表达谱分析中广泛采用的假设“功能相关的基因表达相关”提供了进一步的实验证据。     

DMD基因缺失和重复及其在基因诊断中的应用

本文应用DMD基因位点的cDM02b—3和8探针对正常中国人及20例无亲嫁关系的DMD患者的基因组DNA进行了分析。结果显示,20例病例中有10例可检测到DMD基因缺失,缺失率为50％,缺失的部位、大小不同,呈现遗传异质性。采用双波长薄层扫描仪(CS—910),还发现了两例基因重复的病例,重复率为1％。此外,在两例有缺失的病例中各发现一个大小异常的联接片段。本文讨论了cDNA探针在DMD基因诊断、携带者检出以及产前基因诊断中的应用和价值。     

GFD-Net: A novel semantic similarity methodology for the analysis of gene networks

Since the popularization of biological network inference methods, it has become crucial to create methods to validate the resulting models.Here we present GFD-Net, the first methodology that applies the concept of semantic similarity to gene network analysis. GFD-Net combines the concept of semantic similarity with the use of gene network topology to analyze the functional dissimilarity of gene networks based on Gene Ontology (GO). The main innovation of GFD-Net lies in the way that semantic similarity is used to analyze gene networks taking into account the network topology. GFD-Net selects a functionality for each gene (specified by a GO term), weights each edge according to the dissimilarity between the nodes at its ends and calculates a quantitative measure of the network functional dissimilarity, i.e. a quantitative value of the degree of dissimilarity between the connected genes.The robustness of GFD-Net as a gene network validation tool was demonstrated by performing a ROC analysis on several network repositories. Furthermore, a well-known network was analyzed showing that GFD-Net can also be used to infer knowledge.The relevance of GFD-Net becomes more evident in Section “GFD-Net applied to the study of human diseases” where an example of how GFD-Net can be applied to the study of human diseases is presented.GFD-Net is available as an open-source Cytoscape app which offers a user-friendly interface to configure and execute the algorithm as well as the ability to visualize and interact with the results(http://apps.cytoscape.org/apps/gfdnet).     

Lipofectin介导转移的外源性ADA基因在反复上感儿T淋巴细胞的表达

本文对４１例健康儿童和１７例反复上呼吸道感染患儿外周血淋巴细胞腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）活性进行了检测。在此基础上筛选出２例反复上感伴ＡＤＡ活性低下患儿。在体外对这２例患儿的外周血Ｔ淋巴细胞进行培养后，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（脂质体）介导的方法对其进行了外源性ＡＤＡ基因的基因转移。结果显示：２例患儿体外培养淋巴细胞ＡＤＡ活性较转基因前升高。同步进行的标志基因ｐＢＬａｃＺ的基因转移的检测结果也直观地证实了Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的基因转移是成功的。该研究为ＡＤＡ－ＳＣＩＤ淋巴细胞基因治疗的研究提供了初步的体外实验资料。     

逆转录病毒载体介导的IL-4基因修饰对HL-60细胞增殖及T细胞功能的影响

目的观察ＩＬ－４基因转染对ＨＬ－６０增殖及Ｔ细胞功能的影响及其可能机制。方法采用逆转录病毒载体介导基因转染法将人ＩＬ－４基因导入髓系白血病细胞ＨＬ－６０,观察高表达外源性ＩＬ－４基因ＨＬ－６０株的增殖反应及其诱导的正常人ＰＢＭＣ增殖,ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ基因表达及肿瘤特异性ＣＴＬ杀伤活性。结果ｒＩＬ－４或瘤细胞产生的ＩＬ－４早期促进ＨＬ－６０细胞增殖,培养５天后则明显抑制其增殖;与ｒＩＬ－４处理的ＨＬ－６０细胞比较,ＩＬ－４基因修饰的ＨＬ－６０细胞明显促进正常人ＰＢＭＣ增殖并合成ＩＬ－２、ＩＬ－６及ＩＦＮ－γｍＲＮＡ,其诱导的特异性ＣＴＬ杀伤活性明显高于野生型ＨＬ－６０、仅导入载体的ＨＬ－６０和加入ｒＩＬ－４共育的ＨＬ－６０细胞诱导者。结论ＩＬ－４基因转染在影响ＨＬ－６０细胞增殖和分化过程的同时,可能促进某些抗原（如ＭＨＣⅠ类抗原）的抗原性,从而有利于机体建立有效的抗肿瘤免疫反应。     

纳米生物技术基因治疗载体研究进展

基因治疗已在治疗多种人类重大疾病如遗传病、肿瘤等方面显示出良好的应用前景,但也面临着巨大的挑战,其中之一就是需要安全、高效、靶向的载体系统。纳米生物材料,如脂质体、聚丙交酯-乙交酯(PLGA),聚乳酸(PLA)等,由于具有良好的生物安全性、可方便有效地实现基因靶向性及高效表达和缓释,成为制备高效、靶向的基因治疗载体系统的良好介质,日益在基因治疗载体系统中受到广泛重视。本文综述了目前在基因治疗领域中常用的纳米载体的生物学特性,以及它们的最新研究进展。     

榆次地区非综合征性耳聋患者GJB2基因的检测分析

目的通过对榆次地区100q,J非综合征性耳聋患者GJB2基因突变位点的筛查,了解该地区耳聋基因的突变特点,为耳聋的早期诊断提供依据。方法收集榆次地区100例非综合征性耳聋患者的外周血标本,提取全血基因组DNA后,用聚合酶链反应（PCR）对目的片段进行扩增并测序,结果在GenBank上比对分析。结果100例耳聋患者中,检测到90例患者发生基因突变,其中有3,k位点未见报道：c．54C〉A（2．5％）、c．319h〉G（0．5＊／0）、c．512-5l3insAhCG（O．5％）;4个位点突变发生率较高：C．79G〉A（26．50％）、c．235delC（12．00％）、c．341A〉G（20．50％）、c．765T〉C（13．50％）;另外还检测出8个突变发生率较低的位点：c．109G〉A（1．5％）、C．176-19ldell6（1．00％）、C．223C〉T（1．00％）、c．253T〉C（0．50％）、c．299-300delAT（3．50％）、C．328delG（0．50％）、c．368C〉h（0．50％）、C．608T〉C（2．00％）。结论通过对榆次地区耳聋患者GJB2基因的检测分析,可以明确耳聋患者的病因,了解该地区的耳聋基因突变情况,为今后的耳聋患者的病因学诊断提供参考。     

K562细胞株表达基因探针制作的探讨

目的　研究基因芯片探针的制备方法 ,为K5 6 2细胞基因表达谱芯片的制作及其在基因表达研究中应用打下基础。　方法　以人红白血病K5 6 2细胞株为材料 ,应用一种分离显示基因的新方法即限制性显示 (RD PCR)技术 ,分离DNA片段 ,作为基因芯片探针。　结果　分离到近千个大小在 2 0 0～ 5 0 0bp的基因片段 ,认为该方法可以克服DD PCR中出现的假阳性较多的缺点 ,简单易操作 ,且利用该方法分离的基因探针 ,制备DNA微集芯片 ,同全长cDNA探针制作芯片相比 ,其探针长度小且相对均一 ,杂交动力学易于控制。　结论　限制性显示技术为基因芯片探针的制备提供了一个全新的思路 ,并将大大加速基因芯片技术及其应用研究     

先天性眼球震颤遗传学研究进展

先天性眼球震颤是一种不伴有其他明显眼病的眼科遗传病,该疾病的发生有很高的遗传异质性,已经发现多个致病基因基因座,Xq26–q27、Xp11.4-p11.3、13q31-q33和6p12,可能还有新的基因座没有被发现,已经研究的基因座致病基因侯选区域很大,在该区域的侯选基因太多,所以必须精细定位后,才有可能完成致病基因的克隆工作。本文对先天性眼球震颤遗传学的研究进展进行了综述。     

人结直肠癌组织9p21-22区微卫星改变的研究

目的 研究ｐ１６的改变是不是结进肠癌发展的重要的基因改变,探讨９ｐ２１－２２区的分子遗传学改变与结直肠癌的关系。方法 采用ＰＣＲ、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染色等方法,检测９５例散发性结直肠癌患者癌组织９ｐ２１－２２区４个位点的微卫星改变,包括卫星不稳定性及杂合性缺失,研究其发生率,并将之与临床病理资料进行比较,并对ｐ１６内含子区表现有ＭＳＩ者进行了直接测序,研究内含子结构的改变状态。结果 在９ｐ