共查询到20条相似文献,搜索用时 31 毫秒
1.
从pHamdrl/A质粒用XhoⅠ和SacⅡ将mdrl基因切下后克隆到pBluescriptSK质粒的相应酶切位点获得测序质粒pBSmdrl,测定了mdrl基因的两端序列。用EcoⅠCRI和XhoⅠ从pB-Smdrl切下mdrl基因,定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN和pMSCV2.1,得到携带mdrl基因的逆转录病毒载体pLmdrlSN和pMSCVmdrl。用PA317病毒包装细胞包装后三种携带mdrl基因的病毒具有相似的滴度。用此三种病毒分别感染NIH3T3细胞后,以pHamdrl/A载体mdrl基因产物表达量最高。提示Harvey肉瘤病毒的启动子可能具有较高的强度。 相似文献
2.
结核杆菌Ag85B DNA疫苗的制备及其免疫效应初探 总被引:1,自引:0,他引:1
将结核杆菌抗原Ag85B基因克隆到真核表达质粒pcDNA3中 ,构建成重组pcDNA3 Ag85B ,作为抗结核的DNA疫苗 ,观察其对小鼠免疫应答的能力 ,为进一步研制抗结核疫苗提供依据。1 结核杆菌抗原Ag85B真核表达载体的构建及在Cos 7细胞中的瞬时表达 :由本室构建的重组质粒pUC1 8 Ag85B ,经EcoRⅠ /SalⅠ酶切 ,获得 860bpDNA片段 ,插入经EcoRⅠ /XhoⅠ酶切的载体pcDNA3中 ,用HindⅢ和XhaⅠ酶切分析鉴定阳性克隆 ,获得表达载体pcDNA3 Ag85B。用 5μg纯化的重组质粒pcDN… 相似文献
3.
6种真核表达质粒作为HBV-DNA疫苗免疫小鼠的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
将编码HBV表面抗原的S基因分别克隆到 6种不同的真核表达质粒上 ,包括两种真核质粒载体 (pcDNA3.1,pCI neo) ,两种逆转录病毒载体 (pXT1,pLXSN)和两种EB病毒载体 (pCEP4,pMEP4) ,构建不同的真核表达重组体 ,经酶切鉴定符合要求。将重组体用电转染法导入人肝癌细胞系HepG2获得稳定分泌HBsAg的抗性细胞系。不同重组体表达HBsAg的滴度 ,以逆转录病毒重组基金项目 :国家自然科学基金资助项目(36930 2 80 ,3957660 )作者单位 :重庆医科大学肝病研究所通信作者 :叶珈 30 0 0 70天津医科大学免疫教… 相似文献
4.
将小鼠白细胞介素2(mIL-2)cDNA全序列克隆到逆转录病毒载体pMNSM的PL位点,使其转录受SV40早期启动子驱动,构建pMNSM-SV40-mIL-2。用小鼠白蛋白增强子/启动子(Albe/p)置换pMNSM-SV40-mIL-2中SV40启动子,构建pMNSM-Albe/p-mIL-2。经酶切鉴定符合要求。将重组体用磷酸钙共沉淀法导人逆转录病毒包装细胞pA317中,用所得的重组病毒在8μg/mlPolybrene存在条件下体外感染小鼠肝癌细胞(MM45T.Li、BNLIME)、黑色素瘤… 相似文献
5.
丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 … 总被引:2,自引:2,他引:0
目的:构建包含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(C)基因片段的重组真核表达载体,并在肝细胞癌细胞株7721细胞中表达。方法:将从pBRTMHCV1-3011质粒切下的HCV C基因片段插入pcDNA3质粒的CMV启动子下游,构建真核表达质粒pcDNAHCV-C,然后,采用脂质体转染技术,转染7721细胞进行瞬时表达,转染细胞裂解煮沸后,通过SDS-PAGE及Western blot检测表达的核心抗原 相似文献
6.
乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及其表达 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 为探讨 H B V X 基因在肝细胞癌( H C C) 中的致瘤机理提供实验模型。方法 用限制性内切酶从p Ecob6 上切下 X 基因读码框,克隆到p B K S+ 上,再将 X 片段插入p C E P4 的 Hind Ⅲ和 NotⅠ位点间。将重组载体(p C E P4 X) 和空载体(p C E P4) 导入肝癌细胞株 Hep G2 中,潮霉素选择培养, R T P C R 鉴定其稳定表达。结果 构建的p C E P4 X 质粒在 Hep G2 细胞中有稳定表达。结论 本实验为进一步探讨 H B V X 基因在 H C C 中的致瘤机理提供了理想的实验细胞株。 相似文献
7.
目的:构建包含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(C)基因片段的重组真核表达载体,并在肝细胞癌细胞株7721细胞中表达。方法:将从pBRTMHCV1-3011质粒切下的HCVC基因片段插入pcDNA3质粒的CMV启动子下游,构建真核表达质粒pcDNAHCV-C,然后,采用脂质体转染技术,转染7721细胞进行瞬时表达,转染细胞裂解煮沸后,通过SDS-PAGE及Westernblot检测表达的核心抗原。结果:用限制性内切酶酶切后,片段大小与计算值相符。Westernblot证实,表达抗原的Mr约为22000。结论:HCVC基因能够插入pcDNA3真核表达载体,并使其在真核细胞中表达,为进一步HCV基因疫苗的研制和探讨抗HCV感染打下了基础。 相似文献
8.
细胞内生成的抗整合酶单链抗体阻断HIV—1复制的实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
通通细胞内表达抗HIV-1整合酶单链抗体(IN-sFv)基因,阻断病毒基因组与缩主细胞基因组的整合,进而抑制病毒复制,探讨该基因载体在NIV-1感染基因治疗中应用的意义。方法用带有IN-sFv基因的逆转录病毒表达载体pSLXCMV/INsFV转染PA317包装细胞,并用包装后含有目的基因的逆转录病毒转导SupT1细胞及外周血单个核细胞(PBMC)。以HIV-1NL4-3病毒株感染表达IN-sFv的 相似文献
9.
逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达 总被引:2,自引:0,他引:2
为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒(HBV)反义核酸的方法,用基因重组技术将HBV前C/C基因(PreC/C)和前S/S基因(PreS/S)片段反向插入逆转录病毒载体质粒,再将重组体分别转染PA317包装细胞,进而获得能够介导HBV反义基因向小鼠NIH3T3细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明,含有HBV反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的PA317细胞染色体上;转导的NIH3T3细胞内有HBV反义RNA转录表达。结论:逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导HBV反义基因在真核细胞中转录表达,因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗-HBV基因治疗 相似文献
10.
目的构建带有快速筛选基因标记的逆转录病毒载体。方法构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒载体(GCGFPPXSN),转染包装细胞系PA317,荧光显微镜及流式细胞仪观察结果。结果构建了一个携带快速筛选标记GFP的逆转录病毒载体,其转染包装细胞系后在荧光显微镜及流式细胞仪(FACS)中直接观察到该基因表达。应用该包装细胞系转染T细胞后第2天即表达绿色荧光蛋白,并可用FACS进行分选。结论携带GFP的逆转录病毒载体能够有效转染哺乳类动物细胞,与新霉素筛选基因相比,具有快速、简便的优点 相似文献
11.
HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免?… 总被引:3,自引:1,他引:2
目的 构建HSV-1型SM44株糖蛋白D(gD)基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨HSV-1 gD基因作为基因疫苗的可能性。方法 从HSV-1基因组中扩增gD的全编码基因,克隆入载体pUC19中,测序鉴定后转入真核表达载体pcDNA3.1(+)。所得重组质粒pcD-NA-gD以电穿孔法转染CHO细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用pcDNA-gD免疫小鼠,ELISA法检测基因免疫 相似文献
12.
含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫 总被引:7,自引:0,他引:7
目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)核心(C)基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法:将HCV C基因片段插入真核表达载体pcDNA3质粒CMV启动子的下游,构建真核表达载体pcDNAHCV-C,分别转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和人肝癌细胞7721进行瞬时表达,用免疫荧光法和Western-blot检测表达产物,将重组质粒注射,BALB/c(H-2^d)小鼠股四头肌,ELISA法检测血清中抗体产生水 相似文献
13.
重组HBsAg免疫逃逸突变体的表达及其抗原性分析 总被引:3,自引:1,他引:3
为了深入研究乙型肝炎病毒S基因变异所致的包膜抗原抗原性的改变,从含HBVDNA双拷贝的质粒载体pEcob6,获得一个837bp的HBV-S基因片段,将其插入至载体pBluescript KS~+的SmaⅠ位点,通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变分别获得第145位、126位和第145位+126位氨基酸三种S基因变异型。然后将这些S基因变异片段克隆到真核表达载体pMEp4上,从而构建了含HBV-S基因及其突变型的表达载体PMEp4HBVSM。用其转染人肝癌细胞系HepG2,获得稳定分泌HBsAg及其变异体的抗性细胞系。经体外初步研究表明,HBsAg 145位氨基酸变异体可影响HBsAg的“a”抗原决定簇的结构。 相似文献
14.
15.
基因免疫诱导9.1C3分子内影像类抗独特型抗体的产生 总被引:1,自引:0,他引:1
本文分别采用真核表达载体pEF-BOS及pCMV4构建含起始码和终止码的抗9.1C3分子单克隆抗体重链可变区基因重组表达质粒9.1C3VHpEF-BOS及9.1C3VHpCMV4,并将其分别免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠血清对K562细胞进行间接免疫染色和流式细胞仪分析表明,基因免疫小鼠体内可诱导9.1C3分子内影像类抗独特型抗体的产生。 相似文献
16.
目的 EB病毒BHRF1基因克隆,其表达产物抑制CHO细胞凋亡功能的研究。方法 以B95-8细胞株EBV DNA为模板设计一对引物,采用PCR技术扩增BHRF1基因,用目的基因内的两个单酶切点BamHⅠ、BglⅠ进行酶切鉴定。用引物上所引入的两个酶切位点NcoⅠ、SclⅠ酶切目的基因后定向连接到pBV221载体上,转入宿主菌DH5α经质粒抽提,单、双酶切鉴定,从所获克隆中筛选重组质粒克隆。温控诱导 相似文献
17.
构建HBV同源启动子断裂X基因质粒 总被引:2,自引:0,他引:2
由乙型肝炎病毒(HBV)引起的重症肝炎、肝硬化或肝癌而死亡者高达100~200万例/年。在自然宿主中仅有少数几种病毒与场症有关,HBX蛋白致癌性较强。HBVX基因是HBV4个开架阅读框中最小的一个,对应于1374~1838位核苷酸之间,编码154个氨基酸。该基因表达的HBX蛋白为一种反式激活子。HCC病人的肿瘤和肿瘤周围组织常可发现断裂X基因和完整长度X基因。本文报道利用含有同源启动子质粒p4alx和含有断裂x基因质粒pMT9T41A均建含有同源启动子的中间质粒pXP再加上断裂X基因构建含有同源启动和断裂X基因的质粒pXP9T41A,约4.1kb。并用该质粒与SV40Luc共同转染NIH3T3细胞,表明构建的质粒pXP9T41A能表达HBX蛋白,并与含异源启动子和断裂X基因的质粒pMT9T41A的反式激活作用相类似。含有同源启动子更类似于HBV感染者体内状况。进一步研究该质粒转基因动物中可能的病理变化与肿瘤抑制因子P53蛋白的相互关系,与宿主细胞的整合以及细胞转化能力等,可望为HCC的发病机理的研究提供一种有用的工具。 相似文献
18.
用含HBV全基因和HBV大、中、小分子表面蛋白基因的真核细胞表达质粒(CMV-HBV、CMV-LS、CMV-MS、CMV-S)分别与含HDV cDNA三聚体的重组质粒共转染CHO细胞。转染后3天在上述4种转染细胞内及培养上清中均检出了HDV RNA和HDAg表明上述4种转染细胞的培养上清中均有HDV病毒颗粒的包装和分泌。提示:HDV病毒的包装可能仅需HBV S 基因及其小分子表面蛋白的辅助。 相似文献
19.
应用逆转录病毒载体pZIPNeoSV介导入GM-CSF基因转染肿瘤细胞获得表达。经Lipofectin将含有人GM-CSF基因的重组逆转录病毒功茶pZIP-GM转染兼性病毒包装细胞系PA317,继之用病毒睡获感染人肝癌细胞SMMC7721和人胃癌BGC-823,经GM-CSFJ依赖细胞株TF1活活和双抗体夹心法ELISA法测定表明:人GM-CSF基因在人肿瘤中获得稳定高效表达。 相似文献
20.
通过受体介导法将核酶特异导入肝细胞以阻断HBV蛋白表达的初步研究 总被引:1,自引:0,他引:1
应用半乳糖末端糖蛋白受体(ASGP-R)介导的内吞作用,将外源基因导入真核细胞,与脂质体介导的转染和细胞表面转铁蛋白受体(Tf-R)介导的内吞作用相比,虽然三种方式均能有效介导外源基因的转移,但ASGP-R法具有肝细胞特异性,而脂质体法和Tf-R法不具此特性。将克隆于真核表达载体的针对乙型肝炎病毒(HBV)mRNAPreC/C区的核酶质粒pCMV-Ripc特异性导入肝细胞并发挥作用,通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养液中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg),评价核酶在细胞水平对HBV抗原表达的阻断作用。结果表明当核酶质粒pCMV-Ripc与HBV抗原表达质粒pUC-2HBV共转染HepG2细胞时,核酶对HBsAg和HBeAg表达的抑制率分别为55.29%和68.73%。 相似文献