HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化

目的用基因重组技术将HIV-1p24基因以及gp41基因具有抗原线性中和表位的部分重组连接，构建重组质粒，并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法设计带有酶切位点的引物，分别PCR扩增p24和gp41两个基因，将它们分别连接到pMD18-T载体中，测序验证后，挑选出含有目的基因的正确克隆。将p24片段酶切后连接到gp41基因所在的pMD18T载体中，再将连接后的两个基因酶切，重新连接到pET21a表达载体中。将表达载体转染大肠埃希菌诱导表达，经Western-blot验证表达正确。结果融合蛋白p24-gp41在大肠埃希菌中高效表达。结论融合蛋白p24-gp41可以在pET21a表达载体中高效表达。     

浙江省北部区域人类免疫缺陷病毒1型的分子传播特征

目的:通过构建浙江省北部区域(嘉兴市和湖州市)人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)流行株的分子传播网络,探索HIV-1在该区域的传播特征。方法:以2017年嘉兴市和湖州市新诊断的371例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency ...     

2例人类免疫缺陷病毒Ⅰ型母婴传播病例的毒株序列分析

目的对山东省的2对均为人类免疫缺陷病毒Ⅰ型抗体阳性的母子感染毒株进行核酸检测和序列分析,以探讨他们感染毒株的起源关系.方法采集2对母子的外周静脉防凝血,提取前病毒DNA进行体外扩增,获得核心蛋白（gag）基因的核酸片段,并对其进行测定和分析.结果 2对母子核酸扩增均为阳性,序列分析显示毒株亚型均为A/E,母子之间有高度同源性.结论由分子生物学研究和流行病学资料证实这2对母子是HIV-1母婴传播病例.     

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白120V4区氨基酸位点突变对感染细胞能力的影响

目的 探讨Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)包膜糖蛋白120 V4区氨基酸位点发生突变对CCR5及CXCR4嗜性毒株感染靶细胞能力的影响.方法 根据ADA株为CCR5嗜性毒株,只具有感染CCR5细胞的能力;HXB2株为CXCR4嗜性毒株,只具有感染CXCR4细胞的能力,通过重叠延伸剪接的方法,构建CCR5嗜性及CXCR4嗜性毒株V4区丙氨酸替换突变体.将突变体表达载体与带有荧光报告基因的HIV骨架基因表达载体共同转染真核细胞,制备假病毒颗粒.采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测假病毒中HIV-1 P24抗原,对假病毒进行定量.将假病毒接20、40 ng感染U87.CD4.CCR5和U87.CD4.CXCR4细胞,以野生株ADA和HXB2毒株为对照,通过荧光素酶(RLU)测定,检测HIV-1 V4区氨基酸386-417位点各突变体假病毒对细胞的感染能力.结果 成功构建HIV-1 ADA和HXB2株V4区丙氨酸替换突变体,各获得10株突变体.在ADA株和HXB2株,389-391及414-417位点均发生丙氨酸替换突变体,无论是用20ng,还是40 ng假病毒感染,对CCR5及CXCR4细胞的感染能力均完全丧失[(0±0)％];在ADA株,400-403和408-410位点发生丙氨酸替换突变体,当假病毒在20 ng时,感染细胞的能力达到了(124±35)％和(182±29)％;在40ng时,感染能力达到了(127±8)％和(134±16)％;在HXB2株,395-397位点发生丙氨酸替换突变体,当假病毒在20 ng时,感染能力达到了(144±42)％;在40 ng时,感染能力达到了(121±18)％;两株在其他位点发生丙氨酸替换突变体,但仅保留部分感染细胞能力( 15％ ～ 84％).结论 HIV-1包膜糖蛋白V4区389-391及414-417位点氯基酸发生丙氨酸突变,使病毒完全丧失感染靶细胞能力.     

上海市新诊断114例人类免疫缺陷病毒Ⅰ型感染者的分子生物学研究

目的对上海市2004至2005年新诊断的114例人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（H1V-1）感染者进行分子流行病学调查，为确定上海市流行的HIV-1的分子生物学特征提供监测依据。方法应用逆转录聚合酶链反应扩增HIV-1多聚酶基因，DNA测序后进行进化系统树分析确定基因亚型并与国际耐药数据库比对辨别耐药性突变位点。结果1．114例中除1例不详外，本市户口33例，占28．95％，外来人口80例，占70．18％；经性传播感染51例，占44．74％，经静脉注射吸毒感染43例，占37．72％，经采供血和输血感染3例，占2．63％，感染途径不详17例，占14．91％；2．基因亚型分别为B亚型9例，占7．89％，B’亚型15例，占13．16％，C亚型1例，占0．88％，G亚型1例，占0．88％，CRF01_AE38例，占33．33％，CRF07_BC46例，占40．35％和CRF08BC4例，占3．51％；3．耐药分析结果表明本次研究人群的耐药性主突变率为18．42％。与蛋白酶抑制剂（PRIs）和逆转录酶抑制剂（RTIs）耐药相关的基因主突变率分别为2．63％（3／114）和17．54％（20／114）。蛋白酶基因主突变位点突变频率为M46I，占66．67％，M46L，占33．33％。逆转录酶基因主突变位点突变频率分别为M41L，占7．69％、A62V，占7．69％、T69S，占7．69％、V75I／L，占15．38％、K103R，占25．00％、V118I,占23．08％、V179D／E／T，占33．33％、G190R，占8．33％、L210K／M／X，占38．46％、F227L／I，占16．67％、M230R，占8．33％和P236R，占8．33％。结论上海市新诊断的HIV-1感染者依然以静脉吸毒和性传播为主，感染者以外省市流动人口为主。HIV-1基因亚型流行呈多样性，主要以CRF01_AE、CRF07_BC和B／B’为主。在114例新诊断、尚未经抗病毒治疗的HIV-1感染者中，已存在与PRIs和RTIs耐药相关的基因主突变。     

缅甸人类免疫缺陷病毒-1的二重感染

目的 了解缅甸高危人群HIV-1二重感染的发生情况与特征.方法 收集缅甸HIV-1阳性血浆46份,通过不同PCR测序引物得到不同测序结果或直接测序时碱基模糊,从而确定可能为二重感染病例,然后采用TA克隆的方法对单个PCR克隆进行测序,找到血浆标本中的HIV-1准种,并分析其系统发生和重组结构.结果 46例HIV-1阳性患者中,3例为HIV-1二重感染,发生率为6.5%.此3例患者均通过异性性接触感染,均为CRF01_AE和B′以及两者的重组病毒准种构成的混合感染.结论 缅甸高危人群HIV-1的二重感染较为常见,为快速产生新的重组病毒株提供了基础.

Abstract：

Objective To investigate the occurrence and the characteristics of human immunodeficiency virus (HIV)-1 co/super-infection among high-risk populations in Myanmar.Methods Forty-six HIV-1 positive plasma in Myanmar were collected. Possible cases with HIV-1 co/super infection were identified by discordant sequence results obtained with different polymerase chain reaction (PCR)/sequencing primers or by ambiguous readings in direct sequencing. HIV-1 quasispecies in plasma were then characterized by clonal sequence analysis of independent PCR-clones generated by TA cloning method. Thereafter, their phylogeny and recombinant structure were investigated. Results Co/super infection was identified in 3 (6.5 %) cases among the 46 screened HIV-1 positive patients.All of these three patients were heterosexuals and were co/super infected with CRF01_AE/subtype B′recombinants. Conclusions HIV-1 co/super infections are relatively common and provide a prerequisite for rapid generation of new recombinant forms in Myanmar.     

人类免疫缺陷病毒Tat融合蛋白后的修饰与生物学活性分析

目的分析HIV Tat融合后对融合蛋白生物学活性的影响，探讨HIV Tat的生物细胞膜穿透功能和意义。方法以胸腺激酶（TK）基因为报告基因，将不同长度的甘氨酸（Gly）密码子融合在HIV Tat与TK基因之间以及两种基因倒置融合，分别克隆至PBK原核表达载体，大肠埃希菌表达，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，超声波破碎后，经耦联Tat蛋白单克隆抗体的层析柱层析收集。融合蛋白与HepG2细胞共培养，24h后间接免疫荧光检测。加用更昔洛韦，3d后锥虫蓝染色计算细胞死亡率，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果克隆出含有不同甘氨酸密码子的HIVTat—Gly（n）-TK（n=0，2，4，6）融合基因，成功表达Tat—TK系列融合蛋白和TK—Tat融合蛋白。间接免疫荧光检测发现Tat—TK系列融合蛋白与Tat蛋白、TK—Tat融合蛋白透过膜效率相似；但流式细胞仪检测表明，在培养基含有更昔洛韦的条件下，Tat—Gly（4）一TK、Tat—Gly（6）一TK、Tat—Gly（2）-TK、Tat—TK融合蛋白、HIVTat组和TK—Tat致HepG2细胞凋亡率分别为14．77％、4．30％、12．69％、3．OO％、1．03％和4．40％。锥虫蓝染色发现细胞死亡率也有类似结果，分别为80．2％、56．7％、65．4％、58．4％、9．1％和57．1％，组间比较差异有统计学意义（P〈0．05），但TK—Tat和Tat—TK融合蛋白组之间差异无统计学意义（P=0．24）。结论Tat与TK基因之间融合甘氨酸密码子的数目对融合蛋白中Tat的细胞融合穿透功能不产生影响，而对TK的体外细胞致死作用有较大影响，其中间隔4个甘氨酸密码子对融合蛋白TK体外细胞致死作用的影响最小，同时TK基因与HIVTat的倒置融合不影响两者生物学功能。     

深圳市人类免疫缺陷病毒-1不同亚型分布与传播途径的关联性分析

目的 了解深圳市HIV-1毒株的分布以及与传播途径的关联性.方法 对429例HIV-1感染者进行流行病学调查,采集外周静脉抗凝血,提取核酸,反转录套式PCR扩增包膜蛋白(env)和核心蛋白(gag)基因,结合HIV数据库和Mega软件分析测序结果,确定亚型,建立进化树,计算各亚型不同传播途径基因离散率.结果 在400份合格标本中,属于CRF01_AE207份,CRF07_BC115份,CRF08_BC 14份,CRF02_AG 1份,B亚型49份,C亚型14份.CRF01_AE涉及到同性、异性、静脉吸毒、医源性和血源性等传播途径,其中以性传播为主;血源性传播的10份标本中,9份为B亚型,且B亚型在各传播途径的基因离散率均高于其他亚型.在进化树上,各种传播途径在同一亚型内形成相对独立的簇,但也有交叉.结论 深圳市HIV-1亚型以重组型为主;传播途径以性传播为主;各亚型在各传播途径分布不均衡,各有特点;各传播途径之间存在关联性.     

人类免疫缺陷病毒-1感染者血清趋化因子的检测及克隆构建

目的 探讨调节活化正常T细胞表达与分泌趋化因子(RANTES)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)在HIV-1感染中的作用.方法 以ELISA检测HIV-1感染者(治疗组和未治疗组)和健康对照组人群外周血清RANTES及MCP-1的浓度;构建hRANTES-pcDNA3.1,hMCP-pcDNA3.1及hMCP/hRANTES-pcDNA3.1重组质粒,在CHO细胞中体外高效表达,获得重组蛋白,并研究三者对人外周血单个核细胞的趋化功能.结果 RANTES在健康对照组为(164.3±21.3)pg/mL,未治疗组为(1 224.1±62.0)pg/mL,治疗组为(475.3±36.2)pg/mL;MCP-1分别为(90.6±28.5)、(335.0±30.3)和(807.2±62.6)pg/mL.HIV-1感染后RANTES和MCP-1均升高,有效抗病毒治疗后RANTES有所下降,而MCP-1则明显上升.重组蛋白经Western印迹鉴定,能与各自单克隆抗体结合,且三者对人外周血单个核细胞都有趋化作用,MCP/RANTES融合蛋白的趋化作用更强.在重组蛋白浓度为50、200、400和800 pg/mL时,MCP/RANTES融合蛋白趋化外周血单个核细胞数分别为52×104/mL、102×104/mL、132×104/mL和184×104/mL;RANTES趋化外周血单个核细胞数分别为27×104/mL、51×104/mL、65×104/mL和96×104/mL;MCP-1趋化外周血单个核细胞数分别为18×104/mL、44×104/mL、54×104/mL和74×104/mL.结论 RANTES和MCP-1可能都参与了HIV-1的感染和机体对HIV-1的免疫反应.     

人类免疫缺陷病毒1型特异性CD8+T细胞应答中人类白细胞抗原Ⅰ的限制位点

目的 了解HIV-1特异性CD8＋T细胞应答及其相关的人类白细胞抗原Ⅰ型（HLA-Ⅰ）的限制位点。方法 以位于HIV-1 Gag、Vif、Nef区域的合成肽作为刺激表位，选择来自4例健康者的外周血单个核细胞（PBMC）建立4株EB病毒转化的B淋巴细胞样细胞系（BLCL），以此作为抗原递呈细胞（APC），对1例临床上长期不进展的HIV-1感染者CD8＋T细胞的IFN-γ分泌细胞频率进行体外酶联免疫斑点技术（ELISPOT）测定和HLA—I限制位点比对分析。结果在特异性CD8＋T细胞应答中HLA—1分子能限制性递呈HIV-1表位，且呈现出高特异性；HLA—Ⅰ位点A03、A26、C04和C08限制性递呈HIV-1Gag区域表位，A03和C08还限制性递呈Nef区域表位。结论 HIV-1Gag区域表位的HLA—Ⅰ限制位点可能包括A03、A26、C04和C08，Nef区域表位的限制位点可能包括A03和C08。     

云南省艾滋病主要流行地区人类免疫缺陷病毒1型毒株 gag基因的变异特征

目的调查云南省4个艾滋病主要流行地区人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)毒株gag基因序列的变异特征。方法利用完全随机抽样法抽取2019年1月至2020年12月云南省昆明市、德宏傣族景颇族自治州、红河哈尼族彝族自治州和临沧市抗病毒治疗定点机构进行随访治疗的480例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染/艾滋病患者, 收集其流行病学信息, 采集血浆标本后送至云南省传染病医院进行分析, 采用巢式聚合酶链反应扩增HIV-1gag基因, 并进行基因分型, 采用MEGA 6.06软件构建系统进化树, 采用VESPA在线分析工具分析特征性氨基酸, 采用Distance程序计算gag, 以及gag蛋白不同区段的基质蛋白p17、衣壳蛋白p24、核衣壳蛋白p7及p6蛋白的基因距离。采用SNAP程序分析同义突变频率与非同义突变频率比值(Ks/Ka值)。多组间统计学比较采用方差分析。结果 404例患者成功获得gag基因序列, 其中以男性居多(250例, 61.9%), 年龄为40～59...     

抗HIV-1 gp41单克隆抗体的制备及意义

目的为HIV-1感染的检测和研究提供依据。方法以基因工程重组抗原HIV-1 gp41蛋白免疫BALB／c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备抗gp41蛋白的单克隆抗体（mAb）,用ELISA法鉴定所得mAb的Ig亚类、效价及特异性。单抗经饱和硫酸铵（SAS）纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测gp41蛋白的最佳配伍单抗,分别包被ELISA板及作为酶标mAb,建立双mAb夹心ELISA法。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了12株可分泌高效价mAb的杂交瘤细胞。纯化的腹水mAb经配对试验,选出2株mAb：7D4和9G2-HRP建立了双mAb夹心ELISA法,检测HIV-1 gp41抗原的灵敏度是1μg/L。结论获得12株效价高的抗HIV-1 gp41的mAb,建立了特异性强、灵敏度较高的检测HIV-1 gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。     

风疹病毒包膜糖蛋白E1的原核表达及条件优化

目的 为风疹病毒（RV）感染提供特异性及敏感性高的检测手段。方法采用PCR扩增RV包膜糖蛋白E1基因202—353aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,构建pET30a（＋）-E1,转化BL21（plysS）菌株,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;并探讨温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间对目的蛋白表达产量的影响。结果获得相对分子质量约为16．6kD的融合蛋白,Western Blot证明其具有良好的抗原性,并确定该蛋白在30℃、0．6mmol／L IPTG的条件下诱导表达4h可获得最佳表达量。结论本研究为RV包膜糖蛋白E1抗原纯化及应用奠定了基础,亦为研制生产高特异性和敏感性的RV检测试剂盒提供了实验依据。     

抗反转录病毒治疗人类免疫缺陷病毒/丙型肝炎病毒合并感染者终末期肝病的发生率及危险因素

目的 了解抗反转录病毒治疗(ART) HIV/HCV合并感染人群中终末期肝病的发生率及相关的危险因素.方法 回顾性研究HIV/HCV合并感染者的人口学资料和临床资料.单因素和多因素Logistic回归分析各变量[基线时年龄≥40岁、男性、既往有受血史、HCV持续感染时间、合并HBV感染(HBsAg阳性)、随访末时HIV RNA≥1×104拷贝/mL、随访末时HCV RNA≥1×105拷贝/mL、随访末时CD4细胞计数＞200/μL、随访末时ALT≥2×正常值上限(ULN)、包含奈韦拉平的ART、随访时间、ART持续时间＞5年、HCV基因1b型]与终末期肝病发生的相关性;Kaplan-Meier法分析终末期肝病对HIV/HCV合并感染者生存的影响.结果 共纳入427例HIV/HCV合并感染者,平均随访3.7年,55例患者(12.9％)出现终末期肝病,52例患者死亡,病死率为12.2％.多因素Logistic回归分析显示,基线时年龄≥40岁(OR=2.385,P=0.039)、ALT≥2×ULN(OR=16.374,P=0.000)、合并HBV感染(OR=2.507,P=0.042)、ART持续时间＞5年(OR=3.232,P=0.010)及CD4细胞计数≥200/μL(OR=0.364,P=0.011)与终末期肝病的发生显著相关.在有终末期肝病与无终末期肝病的HIV/HCV合并感染者中,病死率分别为50.9％和6.5％,两组比较差异有统计学意义(P=0.000).结论 随着ART的开展,终末期肝病在HIV/HCV合并感染者中仍较常见,合并终末期肝病明显缩短了HIV/HCV合并感染者的生存期.     

高效抗反转录病毒治疗对人类免疫缺陷病毒感染/艾滋病患者前列腺组织病毒储存库的影响

目的:了解人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者前列腺组织病毒储存库的情况,以及高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy...     

人类免疫缺陷病毒-2 gag重组鸡痘病毒疫苗的构建及实验免疫研究

目的构建并探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)-2 gag重组鸡痘病毒(FPV)在小鼠体内的免疫应答,为开发HIV-2基因重组活载体疫苗提供实验依据。方法将HIV-2结构基因gag插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7．5×20下游．构建出鸡痘病毒重组转移质粒pUTA2-gag;经转染和BrdU加压筛选,以基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌内注射免疫Balb/c小鼠,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果构建出重组鸡痘病毒转移质粒pUTA2-gag;从重组病毒的基因组中可扩增出大小为766bp的目的基因,其表达产物可与人HIV-2阳性血清发生反应,目的蛋白的相对分子质量约为55000;重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体．脾T细胞亚类的数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性。结论获得一株重组鸡痘病毒,该病毒可稳定表达HIV-2结构蛋白Gag,并能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答。     

云南省抗病毒治疗失败的人类免疫缺陷病毒感染/艾滋病患者中人类免疫缺陷病毒1型pol区多态性位点的分布

目的探讨人类免疫缺陷病毒感染/艾滋病(HIV/AIDS)患者接受高效抗反转录病毒治疗(HAART)过程中耐药的发生与多态性位点分布规律间的关系。方法纳入2015年6月至2021年12月云南省16个地级行政区成功扩增得到pol区基因序列的HAART失败HIV/AIDS患者, 采用人类免疫缺陷病毒(HIV)局部序列排比检索基本工具(BLAST)对序列进行亚型鉴定, MEGA 6.0软件进行亚型验证。将样本序列提交至美国斯坦福大学HIV耐药数据库进行耐药位点比对。分析不同耐药程度、治疗方案和HIV-1亚型患者的多态性位点分布情况。采用趋势χ2检验分析不同耐药程度患者多态性位点出现频率变化趋势。统计学比较采用χ2检验并作事后两两比较。结果 1 453例患者扩增获得序列, 耐药检测结果为敏感者954例, 潜在或低度耐药者224例, 中度耐药者189例, 高度耐药者86例。随着HIV-1耐药程度的增加, HIV-1蛋白酶区(PR区)I15V、L19I、D60E和反转录酶区(RT区)E36A、T39D、S48T位点出现频率呈下降趋势(χ2趋势=19.86、9.16、13.66、37.64、18.44...     

人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析

目的 构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3'末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白(Tat-cct)的免疫原性.方法 用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)移位至Tat基因的3'末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析.结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000.Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1～101位氨基酸)均呈特异性结合反应.结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达.并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论.     

汉滩病毒糖蛋白G2酵母双杂交诱饵载体的构建及初步鉴定

目的利用Ras募集系统(RRS),构建并鉴定含汉滩病毒囊膜糖蛋白G2的诱饵载体。方法将汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2基因与Ras基因连接,构建嵌合基因Ras-G2及Ras-G2’(G2’无前导肽序列)。将两个嵌合基因分别克隆入酵母表达载体pMet25,并转化至酵母温度敏感株cdc25-2,检测其对RRS系统的激活作用。结果限制性内切酶酶切鉴定表明,Met-G2和Met-G2’载体构建正确。激活试验结果为阴性。结论Met-G2和Met-G2’载体可用于从cDNA文库中筛选汉滩病毒受体。