p16重组腺病毒联合顺铂或三氧化二砷对人膀胱癌EJ细胞作用的实验研究

目的　探讨 p16重组腺病毒 (Ad p16 )与顺铂 (CDDP)或三氧化二砷 (As2 O3 )联合应用对人膀胱癌EJ细胞体内外生长的抑制效应及机制。　方法　将Ad p16与CDDP或As2 O3 联合应用 ,通过细胞生长抑制实验 ,克隆形成实验 ,细胞周期分析 ,免疫组织化学分析 ,以及裸鼠皮下移植瘤模型 ,观察其对人膀胱癌EJ细胞的作用及机制。　结果　与单独应用相比 ,Ad p16与低剂量的CDDP或As2 O3 联合应用可明显抑制EJ细胞的体外生长 ,诱导EJ细胞凋亡 ,明显阻滞EJ细胞G1期 ;裸鼠体内肿瘤发生时间延迟 ,4周后肿瘤体积与单独应用时相比差别有显著性意义 (P <0 .0 5 )。　结论　Ad p16与CDDP或As2 O3 联合应用 ,有可能进一步提高膀胱癌的治疗效果     

腺病毒介导p16和p53基因联合转导抑制人膀胱癌EJ细胞的增殖活性

目的：探讨p16和p53联合转导对膀胱癌EJ细胞增殖活性的影响。方法：用复制缺陷型腺病毒(Ad)将p16和p53表达质粒PUCl6和PC53—SD3导人细胞，通过细胞形态观察、MTT法、流式细胞术、免疫组织化学、克隆形成及裸鼠肿瘤模型，分析其对EJ细胞生长的影响及机制。结果：Ad-p16和Ad-p53单独应用可抑制EJ细胞体外增殖活性，Ad-p53诱导部分EJ细胞凋亡，Ad-p16感染3d后发生Gl期阻滞，而细胞凋亡不明显；Ad-p16和Ad-p53联合转导可使EJ细胞生长显著抑制、克隆形成率降低、大量EJ细胞凋亡；裸鼠体内肿瘤发生时间、4周后肿瘤体积与单独应用相比有显著性差异。结论：Ad-p16和Ad-p53联合应用可显著抑制膀胱癌EJ细胞的体内外生长。     

p53重组腺病毒联合增殖细胞核抗原反义寡核苷酸治疗膀胱癌的研究

目的：探讨重组腺病毒p53(Ad-p53)与增殖细胞核抗原反义寡核苷酸（PCNA-ASO）联合应用对膀胱癌的抑瘤效应。方法：用腺病毒将p53{感染强度（MOI）100}导入细胞，PCNA-ASO(1.6μmol/L)在脂质体（Lipofectin）介导下转染细胞，通过噻唑蓝比色法（MTT）、流式细胞术、克隆形成、建立移植瘤模型，探讨其体内外抗瘤活性。结果：Ad-p53与PCNA-ASO联合应用明显抑膀胱癌胞EJ(89.3%)和BIU-87(78.6%)生长，细胞克隆形成能力分别下降74.8％和67.5％，S期比率（EJ细胞11.4％，BIU-87细胞14.6％）明显降低，细胞生长受阻于G1期(EJ细胞62.2％，BIU-87细胞56.8％)；联合应用7d后，肿瘤体积较初始分别下降47.6％和36.4％。结论：Ad-p53联合PCNA-ASO可抑制膀胱癌细胞体内外生长，产生协同效应。     

VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨鸡贫血病毒VP3基因在人膀胱癌EJ细胞株中的表达,观察VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌EJ细胞株凋亡的效应。方法用真核表达载体PcDNA3-VP3转染人膀胱癌EJ细胞株,利用RT-PCR技术检测VP3基因在EJ细胞中的表达状况。观察VP3基因和10^-7mol／L、10^-8mol／L、10^-9mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的增殖活性的影响,检测VP3基因和10^-8mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的凋亡作用。结果转染PcDNA3-VP3后VP3基因在EJ细胞中表达。转染重组质粒PcDNA3-VP3、吉西他滨各浓度、VP3基因联合吉西他滨各浓度的EJ细胞株的增殖活性明显下降（P〈0．01）。透射电镜下观察到凋亡细胞的典型形态学特征。TUNAL法检测EJ细胞株凋亡率表现为：转染PcDNA3-VP3组高于对照组（P〈0．01）,10^-8mol／L浓度的吉西他滨组高于对照组（P〈0．01）,联合组高于转染PcDNA3-VP3组（P〈0．01）。结论VP3基因表达能高效诱导人膀胱癌EJ细胞株细胞凋亡,联合10^-8mol／L浓度的吉西他滨能增加VP3基因诱导的人膀胱癌EJ细胞株凋亡。     

Clusterin对膀胱癌细胞抗凋亡作用机制的研究

目的：探讨新的抗细胞凋亡因子Clusterin对膀胱癌EJ细胞的作用机制。方法用丝裂霉素（MMC）诱导膀胱癌EJ细胞凋亡，采用流式细胞术（FCM）检测不同浓度的Clusterin对抗EJ细胞的凋亡率。结果：小剂量Clusterin可以特异性抑制MMC诱导的EJ细胞凋亡作用。结论Clusterin通过抗凋亡机制作用于膀胱癌EJ细胞，可能与膀胱癌细胞的复发、耐药等临床特性有关、此项研究对阐明膀胱癌发生发展的生物学机制以及临床应用Clusterin抗体的治疗胱癌提供帮助。     

重组分泌型内皮抑素腺相关病毒体内治疗膀胱癌

目的观察重组分泌型内皮抑素腺相关病毒（rAAV—ES）在裸鼠模型体内的抗肿瘤作用。方法以rAAV-ES转染（转染复数MOI=1×10^5）膀胱癌细胞（EJ）后建立裸鼠肿瘤模型，检测EJ细胞被转染后的成瘤率及肿瘤生长情况；裸鼠肌注rAAV—ES后检测内皮抑素在体内的表达；建立裸鼠肿瘤模型，检测全身应用rAAV-ES后抑制肿瘤发展的作用、对肿瘤微血管密度（MVD）的影响及其毒副作用。结果被rAAV-ES转染的EJ细胞成瘤率仅为对照组的2／5；体内实验证实肌注rAAV-ES后血清中内皮抑素长期高效表达（30～40）μg/L；全身应用后肿瘤生长速度减慢（32±9）d，瘤体微血管密度变低（8．30±3．14）／0．739mm^2，心脑组织学检查未见缺血和其他异常改变。结论rAAV-ES无毒副作用，可有效地抑制肿瘤的血管生成，从而抑制膀胱癌的发生、发展，其成功包装为原位基因治疗膀胱癌奠定了基础。     

三氧化二砷白蛋白微球抑制人膀胱癌细胞生长的实验研究

目的：研究三氧化二砷白蛋白微球(AsO3—HAS—NS)对人膀胱癌细胞生长的抑制作用。方法：用交联固化的方法制备As2O3—HAS—NS，用原子吸光光度法测量微球中的砷浓度，采用显微镜观察和MTT法研究As2O3—HAS—NS对细胞生长的抑制作用，用^3氢—胸腺嘧啶核苷(^3H—TDR)掺人法测定其体外杀伤活性。用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡。结果：显微镜观察及MTT法显示As2O3—HAS—NS对人膀胱癌EJ细胞体外生长有明显抑制作用，呈现出时间及剂量依赖性。^3H—TDR掺人法测得As2O3—HAS—NS作用的EJ细胞存活率开始较高，但随着时间的延长，较As2O3降低快。流式细胞分析显示As2O3—HAS—NS有明显地促进EJ细胞凋亡的作用，Gn／G1期百分比明显减少，而G2／M期百分比明显增多，至24h达57．1％。24h Sub—G1期细胞占9．4％。结论：As2O3—HAS—NS对EJ细胞的作用优于单纯As2O3，可能成为实体肿瘤治疗的更优剂型。     

内皮抑素抑制膀胱癌皮下移植瘤生长及其机制的初步探讨

目的　探讨人内皮抑素对膀胱癌EJ细胞生长的作用及机制。　方法　 (1)体外实验观察内皮抑素对血管内皮细胞 (ECV30 4 )和膀胱癌EJ细胞生长的影响 ;(2 )EJ细胞移植入裸鼠皮下 ,观察内皮抑素对裸鼠皮下瘤生长情况的影响 ;(3)应用WesternBlot和RT PCR法观察皮下瘤组织中MMPs和TIMP 2的表达。　结果　 (1)内皮抑素具有抑制bFGF刺激后的内皮细胞ECV30 4及抑制EJ细胞增殖的作用 (P≤ 0 .0 5 ) ;(2 )治疗组皮下肿瘤质量 (0 .70± 0 .16 ) g ,对照组为 (1.14± 0 .2 1) g ,两组比较 ,差别有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;(3)人内皮抑素抑制裸鼠皮下膀胱癌瘤MMP 9mRNA表达 ,对MMP 2、TIMP 2、MT1 MMPmRNA表达无影响 ;(4)瘤组织中未检测到MMP 2、MMP 9和TIMP 2蛋白。　结论　人内皮抑素具有抑制膀胱肿瘤生长的作用 ,其作用机制与抑制MMP 9表达有关     

三氧化二砷对小鼠膀胱癌细胞系细胞内游离钙浓度影响的实验研究

目的：研究As2O3对小鼠膀胱癌细胞系WYH929肿瘤细胞内游离钙离子浓度的影响。方法：用钙离子荧光探剂Fura2-AM,以荧光分光光度计检测As2O3对膀胱癌细胞内游离钙离子浓度的变化。结果：As2O3可以使肿瘤细胞[Ca^2 ]i水平明显升高，由88nmol/L逐渐升高至230nmol/L，存在明显的量效关系（P＜0．05），而与细胞外钙离子浓度变化无关（P＞0．05）。结论：As2O3影响小鼠膀胱癌细胞株WYH929肿瘤细胞内钙稳态，诱导肿瘤细胞内钙离子浓度持续升高；这可能是其抗肿瘤，诱导肿瘤细胞凋亡作用的机制之一。     

三氧化二砷抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长及其作用机制的探讨

摘要：目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人乳腺癌细胞系MCF 7细胞裸鼠背部皮下移植瘤生长的抑制作用及其作用机制。方法 建立BALB/C nu/nu裸鼠MCF 7人乳腺癌皮下移植瘤模型，以不同浓度的As2O3行腹腔内注射，与5 氟脲尿嘧啶（5 FU）治疗进行对比，观察移植瘤的瘤重及瘤重抑制率。通过流式细胞仪检测移植瘤的凋亡情况，免疫组织化学法检测bcl 2，Fas基因表达水平的变化，并进行血常规及骨髓涂片检查。结果 5 FU（8mg/kg）组，As2O3 （4mg/kg）组，As2O3（8mg/kg）组均能明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长，抑瘤率分别为38.33%，51.42%和62.43%；As2O3对移植瘤的生长抑制作用明显强于5 FU，差异有显著性 (P<0.01)。两种浓度As2O3组MCF 7细胞凋亡率明显高于5 FU组。各实验组乳腺癌细胞存在G2/M期阻滞，在G1峰前出现明显的凋亡峰。移植瘤组织中bcl 2蛋白阳性细胞数明显减少，Fas蛋白阳性细胞数明显增加。血常规及骨髓涂片计数显示As2O3实验组未见造血系统功能受抑，与5 FU组相比较，差异有显著性(P<0.05)。结论 As2O3可明显抑制乳腺癌移植瘤的生长，诱导移植瘤MCF 7细胞凋亡；其作用的机制可能是下调bcl 2基因表达，上调Fas基因表达。     

Adp27KIP1基因的过度表达对人膀胱癌细胞系EJ的抑制作用

目的　探讨ｐ２７ＫＩＰ１ 的过度表达对人膀胱癌细胞系ＥＪ的影响。　方法　构建含人ｐ２７ＫＩＰ１ 基因的重组缺陷腺病毒,并感染ＥＪ细胞,７２ 小时后检测ｐ２７ＫＩＰ１ 蛋白的表达、生长曲线、克隆形成率和细胞周期分布。　结果　转基因后,ＥＪ细胞过度表达ｐ２７ＫＩＰ１ 蛋白,增殖明显受阻,细胞停滞于Ｇ１ 期。　结论　ｐ２７ＫＩＰ１ 的过度表达可明显抑制ＥＪ细胞的增殖,提示ｐ２７ＫＩＰ１ 基因在人膀胱癌的发生中起重要作用,用重组腺病毒转ｐ２７ＫＩＰ１ 基因可成为潜在的膀胱癌治疗方法。     

Adenoviral p53 gene transfer in human bladder cancer cell lines: cytotoxicity and synergy with cisplatin

Mutations of the tumor suppressor gene p53 are common in bladder cancer. To determine whether p53 gene transfer would lead to decreased viability of bladder cancer cells, we studied the effect of p53 gene transfer in human bladder cancer cell lines with either mutant or wild-type p53. Bladder cancer cell lines 5637 and J82 (which express only mutant p53) and 253J-BV (which expresses wild-type p53) were transduced with vectors containing the β-galactosidase gene (Ad5-lacZ), wild-type human p53 gene (Ad5CMV-p53), or no foreign gene (DL312 or Ad5-polyA). X-gal staining of cells exposed to Ad5-lacZ showed that the adenoviral vector was capable of transducing each of the cell lines. Increases in p53, p21^waf1/cip1 and bax protein were demonstrated following exposure to Ad5CMV-p53, and there was a dose-dependent increase in the number of apoptotic cells. Cell viability was decreased in all three cell lines, although J82 was less sensitive than either 5637 or 253J-BV. To determine whether cisplatin increases sensitivity of J82 cells to Ad5CMV-p53, we performed median effect analysis for cisplatin combined with Ad5CMV-p53 or DL312. The combination index for cisplatin plus Ad5CMV-p53 revealed synergy, whereas cisplatin and DL312 were only additive. These results suggest that forced p53 gene expression is cytotoxic to human bladder cancer cells with either p53 mutant or wild-type background, and that combination with cisplatin is a potential method for overcoming resistance.     

腺病毒介导LRIG1过表达联合顺铂对膀胱癌细胞株EJ的抑制作用

目的 观察腺病毒介导的LRIG1过表达是否能增强顺铂对膀胱癌细胞株EJ的损伤作用.方法 构建重组腺病毒载体包装pLRIG1-GFP质粒,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法鉴定其是否能在膀胱癌细胞株EJ中上调LRIG1表达,并下调表皮生长因子(EGFR)的表达水平.通过采用单细胞凝胶电泳实验、流式细胞技术、免疫细胞化学染色及Matrigel侵袭实验,对比对照组、顺铂单药组、顺铂联合腺病毒载体组和顺铂联合腺病毒介导的LRIG1过表达组间细胞DNA损伤,细胞凋亡、增殖及侵袭能力.结果与对照组比较,顺铂在联合腺病毒介导的LRIG1过表达后,能下调细胞EGFR表达水平,同时显著增强肿瘤细胞DNA损伤程度(OTM值,对照组:2.54±0.54;CDDP组:4.57±0.79;CDDP/Ad-GFP组:5.38±1.16;CDDP/Ad-LRIG1组:9.45±2.64);引起细胞周期抑制[S期抑制,对照组:(40.82±2.11)%;CDDP组:(37.31±1.12)%,CDDP/Ad-GFP组:(37.57±2.52)%,CDDP/Ad-LRIG1组:(55.04±4.28)%];诱导细胞凋亡[细胞凋亡率,对照组:(2.63±2.49)%,CDDP组(3.49±1.94)%,CDDP/Ad-GFP组:(3.96±4.68)%,CDDP/Ad-LRIG1组:(12.56±0.77)%];抑制细胞增殖[细胞计数,对照组:(371.33±16.17)个;CDDP组:(224.67±88.06)个;CDDP/Ad-GFP组:(176.33±69.79)个;CDDP/Ad-LRIG1组:(138.33±8.39)个]并逆转细胞侵袭性[细胞侵袭数量,对照组:(259.40±9.21)个;CDDP组:(175.00±25.78)个;CDDP/Ad-GFP组:(157.20±22.79)个;CDDP/Ad-LRIG1组:(114.20±25.11)个].结论 腺病毒介导LRIG1过表达能增强顺铂对膀胱肿瘤细胞株EJ的损伤作用.     

外源性p16基因导入对人膀胱癌细胞的作用

目的 通过外源性野生型Ｐ１６基因,纯翕生缺失及具有内源性Ｐ１６基因表达的膀胱癌细胞系２５３Ｊ和ＥＪ,地肿瘤细胞的生长抑制作用,并探讨共作用机制。方法 构建Ｐ１６逆转逆转录病毒表达载体,经细胞ＰＡ３４１７包装,膀胱癌细胞系;应用Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交及免疫细胞化学方法检测外源１６基因的表达;流式我仪检测细胞周期;原位细胞凋亡检测及透射电镜观察细胞凋亡;并对导入的Ｐ１６基因的细胞进行鼠致瘤能力及病理不特性     

Inhibitory effects on in vitro cell growth of human urothelial tumor cell lines under the combined administration of hematopoietic growth factors and clinically relevant antineoplastic agents

Summary In five of eight human transitional carcinoma cell (TCC) lines a proliferative response has been reported during exposure to interleukin-3 (IL-3), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony stimulating factor (GM-CSF). To elucidate possible growth-modulating effects of these factors combined with clinically relevant antineoplastic agents, cells of the human TCC lines EJ28 and T24 were exposed to methotrexate (MTX), vinblastine (VBL), doxorubicin (DXR) and cisplating (CDDP) with and without single or continuous exposure to IL-3, GM-CSF and G-CSF at concentrations of 1–100 ng/ml. Compared with cells exposed only to chemotherapy, significant inhibitory effects occurred as a result of continuous exposure to IL-3 or GM-CSF at the highest activities with CDDP and MTX in the T24 and EJ28 lines; continuous G-CSF administration (100 ng/ml) in combination with MTX led to significant growth inhibition in the EJ28 line. In contrast, no significant growth modulation was found on combined administration of DXR or VBL with any one of the three colony stimulating factors tested.     

Epidermal growth factor receptor targeting of replication competent adenovirus enhances cytotoxicity in bladder cancer

PURPOSE: We evaluated the delivery and oncolytic potential of targeted replication competent adenoviruses in bladder cancer lines. MATERIALS AND METHODS: Seven established human bladder cancer tumor lines (5637, SW800, TCCsup, J82, Scaber, T24 and 253J) were studied for the expression of integrins alpha(v)beta3, alpha(v)beta5, Coxsackievirus and adenovirus receptor, epidermal growth factor receptor (EGF-R) and epithelial cell adhesion molecule antigens using flow cytometry analysis. Bispecific single chain Fv fragments were used to target replication deficient luciferase reporter adenovirus to EGF-R (425-s11) or to epithelial cell adhesion molecule (C28-s11) antigens. Moreover, a fiber modified adenovirus targeting alpha(v)-integrins was studied. Replication competent serotype-5 adenoviruses attenuated to replicate specifically in retinoblastoma pRb (Ad5-d24) or p53 deficient (Ad5-d55K) cells were tested in vitro for oncolytic properties. RESULTS: Low to absent Coxsackievirus and adenovirus receptor expression was found in 5 of the 7 tumor lines (SW800, J82, T24, 5637 and Scaber). EGF-R expression was found in all cell lines, whereas elevated epithelial cell adhesion molecule expression was seen in 3 (5637, Scaber and TCCsup), alpha(v)beta3-integrin was found in 1 (Scaber) and alpha(v)beta5-integrin was found in 3 (TCCsup, 253J and T24). EGF-R targeting using 425-s11 improved transgene expression in all cell lines from 2.1 to 12.5 times over nontargeted viruses. Epithelial cell adhesion molecule and integrin targeting was inferior to EGF-R targeting with a maximal increase in transgene expression of 2 times for epithelial cell adhesion molecule in 5637cells and 1.6 times for integrin targeting in T24 cells. Comparison of the wild-type replication competent virus with conditionally replicating adenoviruses (Ad5-d55K and Ad5-d24) showed superior oncolytic activity for the latter 2 in all lines. Furthermore, improved cytotoxicity (29% to 33%) was obtained in 4 of the 7 lines after pre-incubation of Ad5-d24 with 425-s11. CONCLUSIONS: EGF-R directed bispecific single chain antibodies enhance adenovirus mediated transgene expression and oncolysis in bladder cancer lines.     

顺铂诱导原代培养人膀胱癌细胞凋亡的实验观察

为探讨顺铂诱导原代培养膀胱癌细胞发生凋亡变化的特征及机理,以O～100μm浓度顺铂处理原代培养膀胱癌细胞12～72小时,应用MTT法检测细胞增殖抑制变化,分析其与凋亡指数(AI)的关系,采用光镜和透射电镜分别观察膀胱癌细胞凋亡变化的特征．结果表明顺铂能够明显地诱导膀胱癌细胞凋亡,具有一定范围内的作用时间和药物浓度依赖性,与细胞增殖抑制密切相关．膀胱癌细胞凋亡的镜下特征为胞膜完整,胞浆浓缩,核碎裂、萎缩或边积,胞浆外突形成凋亡小体．本研究证实顺铂诱导膀胱癌细胞广泛性凋亡是它产生杀瘤效应的途径之一．