霍乱弧菌4种新类型tcpA基因发现及序列分析

目的研究中国霍乱弧菌（VC）毒力协同调节菌毛A亚单位基因（tcpA）的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型（EVC）产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA基因均与EVC国际标准株N16961株为同一类型（t2型）.50株EVC非产毒株中只有3株携带tcpA基因,1株为t2型,另2株为2种新类型.20株O139群VC非产毒株均不携带tcpA基因.20株非O1非O139群VC中只有2株携带tcpA基因,且为2种新类型.4种新类型tcpA基因与国外发现的4种类型比较,基因序列及推测的氨基酸序列同源性分别为58.3%～77.5%和61.0%～85.5%;5′端约102bp基因序列基本一致,推测的氨基酸序列完全一致;3′端约210bp基因序列变异最大,推测的氨基酸序列变异也最大.抗原表位分析,C末端差异最大.结论建立快速准确区分不同类型tcpA基因的方法,并发现4种新类型.     

霍乱弧菌毒力相关基因检测分析

目的:对霍乱弧菌临床及外环境分离株进行毒力相关基因检测,以了解其毒力相关基因的携带情况.方法:采用PCR方法对霍乱弧菌进行6种毒力相关基因的检测.结果:所有检测的霍乱弧菌rtxA均为阳性,具有3种毒力基因型.结论:毒力相关基因检测能反映不同类型菌株间的分子特征,对于霍乱的分子流行病学研究及预防控制具有重要意义.     

O139群霍乱弧菌16S rRNA基因分型分析

[目的]研究北京市O139群霍乱弧菌的分子生物学特征。[方法]对北京市1998～2000年的30株O139群霍乱弧菌进行PCR霍乱肠毒素（CT）基因检测,以16SrRNA为探针对菌株DNA进行Southern杂交后对图谱进行核糖体基因（RT）分型分析。[结果]对30株霍乱弧菌RT图谱进行分析,共存在5种16SrRNA核糖体基因型,其中CT阳性的O139群霍乱弧菌为RT1型,CT阴性的O139群霍乱弧菌为RT2-RT5型。[结论]北京市不同年份的O139群霍乱弧菌CT阳性菌株核糖体基因型较为单一,CT阴性菌株基因型具有明显的多样性。提示北京市O139群霍乱弧菌CT阳性菌株和CT阴性菌株遗传发生上相距较远。     

山东省分离的霍乱弧菌毒力基因的研究

目的：了解山东省不同年代、不同地区收集的霍乱菌株携带的毒力基因情况、分布特点和变迁。方法：应用分子杂交、PCR技术对霍乱弧菌的CTX基因元件中的ctxA、zot基因，VPI毒力岛中的tcpA、tcpH、aldA、toxT、acfB基因，TLC因子中的cri、orf2—3基因，RTX基因簇中的rtxA、rtxC，以及toxR基因进行了检测。结果：用原位杂交检测，180株霍乱弧菌中有168株携带CTX遗传单元中的ctxA、zot、RS1基因，阳性率均为93．33％，表现出高度的一致性。用打点杂交检测不同时期的28株01群霍乱弧菌，所有被检菌都具有ToxR、RTX相关基因，在1980～1987年间分离的O1群霍乱弧菌流行株中，有92．86％携带编码TLC因子的基因，而1994～2000年间分离的流行株菌株中编码TLC因子的基因携带率仅有7．14％。Southern杂交结果显示，48株O1群霍乱弧菌可产生大小为9．4kb和6．5kb左右的两条ctxA杂交带，用zot基因探针进行杂交，11株O1群霍乱弧菌可产生与ctxA杂交带同样大小的条带。1株O139霍乱弧菌具有检测的所有毒力基因，但其ctxA（zot）杂交带与O1群霍乱弧菌有差异。结论：目前已知的霍乱弧菌毒力基因在山东省分离到的菌株中有广泛的分布，并且随时间的推移而发生变迁。     

霍乱弧菌O139和El Tor菌株tcpA分子特征的研究

[目的]从霍乱弧菌XJ93006、MO45、XJ89079中克隆毒素协同调节菌毛亚单位A（tcpA）基因（包括侧序列）并测序比较。[方法]PCR扩增tcpA片段;克隆该片段;提取质粒经鉴定后测序并利用DNAMAN对该序列进行序列分析,比较。[结果]成功构建XJ93006、MO45、XJ89079 tcpA基因的重组质粒。三株霍乱弧菌及与N16961 tcpA基因及其两侧核酸序列同源性XJ89079和N16961为100%,XJ93006和XJ89079为99.8%,XJ93006和MO45为99.5%,XJ89079和MO45为99.7%。[结论]该研究初步认为我国新疆VC O139与本地EVC关系密切。     

湖北省部分霍乱弧菌毒力基因和基因分型结果分析

目的检测霍乱弧菌毒力基因和基因分型,为科学防治提供依据。方法用PCR方法检测从湖北省部分地区的猪肉、基围虾、湖水、病人、病人厕所等处采集标本培养分离血清学分型确认的霍乱弧菌毒力基因,采用脉冲场电泳技术（PPGE）检测霍乱弧菌基因分型。结果同一地区的猪肉、基围虾、湖水中01群小川型霍乱弧菌基因分型结果一致,毒力基因阴性;病人及病人厕所0139群霍乱弧菌基因分型结果一致,毒力基因为阳性。结论检测猪肉、基围虾、湖水中霍乱弧菌毒力基因阴性的结果,可以为现场提供避免采取应急防治措施的依据,节约大量的社会和人力资源。     

2001至2005年广州地区霍乱弧菌主要致病相关基因特征分析

目的 应用多重聚合酶链反应（PCR）检测方法和测序研究近5年广州地区分离的霍乱弧菌的4种致病相关基因的携带情况及霍乱肠毒素基因ctxA的变异情况。方法针对霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）、小带联结毒素基因（zot）、辅助霍乱肠毒素基因（ace）、毒素共调菌毛亚单位A基因（tcpA）设计引物,将多重PCR方法应用于广州地区分离的276株霍乱弧菌的致病相关基因的检测。对ctxA基因的PCR扩增产物进行核苷酸序列测定,探讨ctxA扩增产物的同源性。结果 近5年广州地区分离的276株霍乱弧菌中,人源株中93．9％为致病相关基因A型（ctxA^＋tcpA^＋ace^＋zot^＋型）菌,其余6．1％为致病相关基因C型（ctxA^-tcpA^-ace^-zot^-型）菌,临床分离的致病相关基因A型菌分离自轻、中、重型病例和带菌者,其中有68．5％分离自轻型病例,21．9％分离自带菌者,临床分离的致病相关基因C型菌中有63．6％分离自轻型病例,36．4％分离自带菌者,C型菌引起带菌者的比例高于A型菌;78株环境分离株中9．0％为致病相关基因A型菌,35．9％为致病相关基因B型（ctxA^-tcpA^-ace^＋zot^＋型）菌,55．1％为致病相关基因C型菌。霍乱肠毒素基因ctxA变异较小。结论 多重PCR方法揭示了广州地区霍乱弧菌致病相关基因模式的多态性,为深入研究人源和环境来源霍乱菌株致病相关基因的演化提供了有效手段,并对本地区霍乱的预防、控制和预警具有重要的指导意义。     

霍乱弧菌VPI毒力岛的tcpI-P和tcpH-A间隔区序列在不同菌株中的差异分析

目的：TcpA是霍乱弧菌主要定居因子毒素共调菌毛的主要亚单位，基因位于VPI毒力岛上。古典生物型和EI Tor生物型霍乱弧菌菌株的tcpA序列有较大差异，同时毒力岛上其他一些区域，主要包括部分基因的间隔区序列也存在差异。我们已在不同EI Tor流行株与非流行株以及非01／非O139菌株中又发现4种新的tcpA序列。笔拟探明这4种不同类型tcpA序列的菌株中，VPI毒力岛上其他几个差异片段(tcpI—P间隔区和tcpH—A间隔区)是否与相应tcpA序列有平行的变异关系、进而分析毒力岛和菌株分化的多样性。方法：在tcpI—P和tcpH—A间隔区外侧保守区中设计引物，扩增包含这两个间隔区的片段并进行测序，计算比较序列差异。结果：基因tcpH与tcpA之间的间隔区序列两两间比较的一致性在63．3％至95．3％之间；基因tcpI与tcpP之间的间隔区序列两两间比较的一致性在26．7％至100％之间。这些间隔区序列并没有像tcpA序列在这些菌株中的差异那样显示出类似的变异水平，甚至一些菌株的tcpA序列有较大差异时、某些区域反而高度一致。结论：在不同tcpA序列的菌株中tcpI—P间隔区和tcpH—A间隔区及tcpA这三个片段分化变异的速率不同，并不具有平行性。这些序列的多样性反映了霍乱弧菌VPI毒力岛以及菌株分化的多样性。这种分化也提示可能与这些区域具有结合一些调控因子、从而对环境信号产生不同方式或程度的应答的功能有关。     

2005年上海市霍乱弧菌菌株表型及ctxA毒力基因分析

目的：分析本市2005年不同来源01群和0139群霍乱弧菌菌株表型和ctxA毒力基因特征。方法：以PCR方法，对所有菌株进行ctxA毒力基因检测。采用WHO推荐的改良K—B纸片法，对所有菌株均进行了12种抗菌药物的药敏试验。结果：从病人和外环境中分离出的0139群霍乱弧菌均为产毒株；从病人中分离出的01群霍乱弧菌流行株均产毒，外环境中分离出的非流行株少数也产毒。0139群霍乱弧菌菌株耐药谱较01群霍乱弧菌菌株广；两者对氨苄青霉素、强力霉素、庆大霉素、复方新诺明、利福平耐药率有显著差异。结论：本市2005年霍乱的流行株都是产毒株，但产毒株不一定是流行株。药敏结果显示，对01群和0139群霍乱弧菌应采取不同抗菌治疗，0139群霍乱弧菌多重耐药应引起重视。     

112株霍乱弧菌的生物学特性、毒力基因和耐药变迁的研究

目的：了解浙江温岭霍乱弧菌的生物学特性、毒力基因和耐药情况,为霍乱防治提供科学依据.方法：以霍乱弧菌主要毒力因子基因ctx为引物,对112株霍乱弧菌（O1群92株、O139群20株）进行了PCR扩增.采用WHO推荐的改良K-B纸片法,对所有菌株进行了18种抗菌药物的药敏试验.结果：除外环境检出的4株O1群霍乱弧菌菌株外,其余的霍乱菌株均扩增出与阳性对照一致的ctx毒力基因条带.药敏试验结果显示O139群霍乱弧菌的耐药性明显高于O1群霍乱弧菌,不同年份的菌株耐药的程度不一致.结论：从所有病人中分离到的菌株均为产毒株,与致病性和流行强度有关,治疗霍乱病人应结合本地区情况,根据不同菌型选择相应的抗生素药物.     

广东省O1/O139群霍乱弧菌耐药监测分析

目的分析广东省霍乱病例及环境来源O1/O139群霍乱弧菌对抗生素的敏感性,为霍乱防控提供依据。方法选取2006-2008年广东省O1/O139群霍乱病例分离株38株,环境株145株,以毒素基因ctxAB的PCR检测区分产毒株与非产毒株;采用WHO推荐的改良Kirby-Bauer纸片法,分析霍乱弧菌对11种抗生素在体外的药物敏感性。结果183株O1/O139群霍乱弧菌中,ctxAB阳性44株,ctxAB阴性139株。分离自病例的菌株和ctxAB阳性菌株中,小川型菌株只对四环素、萘啶酸和复方新诺明有一定耐药;稻叶型菌株对萘啶酸和复方新诺明100%耐药,而O139群菌株对四环素、萘啶酸和复方新诺明等多种抗生素有一定耐药;分离自环境的菌株和ctxAB阴性菌株中,小川型和稻叶型菌株对四环素、萘啶酸和复方新诺明等多种抗生素有一定耐药,而O139群则仅对萘啶酸、复方新诺明和氨苄西林有一定耐药;分离自病例的菌株和ctxAB阳性菌株以耐多药为主,耐多药率分别为78.9%和75.0%,高于分离自环境的菌株和ctxAB阴性菌株的31.7%和30.9%(P0.01)。结论广东省O1/O139群霍乱弧菌中分离自病例的菌株和ctxAB阳性菌株耐多药率较高,应予以密切关注。     

广东省2009-2014年霍乱弧菌耐药监测分析

目的 了解广东省2009-2014年霍乱弧菌耐药情况,为霍乱临床合理用药和防治提供科学依据。方法 采用WHO推荐的改良K-B纸片扩散法,对在广东省2009-2014年收集的253株霍乱弧菌进行12种抗菌药物的药敏试验。结果 广东省2009-2014年共收集分离霍乱弧菌O1群189株(小川型72株,稻叶型117株),O139群26株,非O1/O139群38株;药敏结果显示,253株霍乱弧菌对头孢噻肟(CTX)和头孢曲松(CRO)均100% 敏感,对诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)的敏感率分别为98.8% 、98.4% 、98.0%;O1群小川型、O1群稻叶型、O139群、非O1/O139群霍乱弧菌比较,不同血清型霍乱弧菌对萘啶酸(NAL)、四环素(TCY)、多西环素(DOX)、复方新诺明(SXT)、氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、氯霉素(CHL)等抗生素的耐药率差异均有统计学意义(均P<0.05);多重耐药分析结果显示,37.5% 的菌株同时对≥3种抗生素耐受,其中有12株O1群稻叶型菌株同时对≥6种抗生素耐受,有3株O1群小川型和1株非O1/O139群菌株同时对6种抗生素耐受,有2株O139群菌株同时对4种抗生素耐受。结论 CTX、CRO、NOR、CIP、AMK对霍乱弧菌的敏感率较高;非O1/O139群霍乱弧菌感染比例增高且部分菌株表现出多重耐药现象,应加强此类菌株的耐药监测。     

广东省外环境O1/O139群霍乱弧菌毒力基因分型

目的 分析广东省外环境来源O1/O139群霍乱弧菌毒力基因的携带及基因分型特征,为霍乱防控提供依据.方法 选取2008—2009年广东省O1/O139群霍乱弧菌水体分离株69株,水产品分离株16株和同期病例分离株5株,应用多重聚合酶链反应对ctxA、ace、zot、tcpA、tcpI、hlyA、ompU、toxR等8种毒力基因进行检测和分型分析.结果 90株O1/O139群霍乱弧菌均携带hlyA和toxR基因;5株病例菌株中有3株携带8种毒力基因,另外2株小川型菌株为非产毒株,基因型为hlyA⁺toxR⁺ompU⁺zot⁺tcpA⁺tcpI⁺型和hlyA⁺toxR⁺tcpA⁺型;水体菌株中,稻叶型菌株以hlyA⁺toxR⁺ompU⁺ace+zot⁺tcpI⁺型(34.15%)为主,小川型(66.67%)和O139群(70%)以hlyA⁺toxR⁺型为主;水产品菌株中,稻叶型菌株以hlyA⁺toxR⁺ompU⁺tcpI⁺型(75.00%)为主,小川型菌株各种基因型别均有分布,无明显优势基因型别.结论 广东省外环境来源O1/O139群霍乱弧菌以非产毒株广泛存在,毒力基因型别多样.     

一株非典型O1群霍乱弧菌实验室诊断与分析

目的:一株从腹泻病人分离到的O1群霍乱弧菌的实验室鉴定和毒力基因的检测与分析。方法:细菌的分离和鉴定按照卫生部疾病控制司第五版《霍乱防治手册》进行;用PCR方法对该菌株的ctxA、rtxA、Ace、TcpA、Cri、Zot 6种毒力基因进行检测。结果:经分离培养、生化反应、噬菌体-生物分型,确定该菌株是埃尔托霍乱弧菌5 e型流行株,菌落形态不典型,毒力基因TcpA、rtxA阳性,其它毒力基因均为阴性。结论:尽管该菌株从腹泻病人分离且确定为埃尔托流行株,但其霍乱肠毒素主要控制基因ctxA阴性,且菌落形态不典型,该菌是一株非典型的O1群霍乱弧菌。     

湖南省2005年-2010年霍乱疫情分离株的毒力基因PCR及PFGE分型分析

目的:了解2005年-2010年湖南省霍乱疫情分离到的O139群霍乱弧菌菌株的病原学特征,研究疫情分离株之间的克隆相关性。方法:采用K-B法进行药敏试验;聚合酶链反应(PCR)检测ctxAB毒力基因;脉冲场凝胶电泳对疫情分离代表株进行PFGE分型分析。结果:33株霍乱弧菌对强力霉素、复方新诺明的耐药率较高,分别为39.39%和75.76%,对环丙沙星、诺氟沙星以及丁胺卡那100%敏感;毒力基因的PCR结果显示为所有疫情分离的O139霍乱弧菌均为产毒株,即霍乱肠毒素基因ctxAB阳性;24株分离自2005年和2010年的7起疫情里的O139霍乱弧菌进行PFGE分型及聚类分析后,共分为3个PFGE带型,所有菌株的带型相似率在83%～100%之间。结论:湖南省2005年-2010年霍乱疫情以O139群为主,引起疫情的全部为产毒株,不同年份不同地区之间霍乱疫情的分离菌株之间存在着紧密相关的流行克隆群,对分离菌株进行耐药性监测和进一步的分子分型分析,有助于霍乱的主动监测和传染来源的追踪。     

应用脉冲场凝胶电泳技术对江西省霍乱暴发和常规监测菌株的分析

为了解江西省霍乱弧菌流行菌株的分子分型特征，分析爆发性流行和环境与食品监测菌株的特征及相关性，我们运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法对江西省2004年部分O1群、0139群霍乱弧菌分离株进行了分子流行病学研究。