小鼠耳蜗毛细胞体外培养研究方法

目的建立耳蜗Corti器体外培养模型.方法取刚出生2～3天小鼠耳蜗,采用鼠尾胶表面平铺培养并结合荧光染色方法观察耳蜗毛细胞的生长情况.结果耳蜗基底膜经1～5天培养,内、外毛细胞和支持细胞生长良好,排列有序,无任何衰亡和缺损.结论耳蜗Corti器可以在体外培养环境存活一定时间并健康生长.     

大鼠耳蜗感觉上皮细胞的原代培养及其意义

目的：建立大鼠耳蜗感觉上皮细胞（CSEC）的原代培养体系，为研究毛细胞再生的分子机制提供大量来源一致的细胞。方法：取出生1d（P1）的大鼠耳蜗感觉上皮（Corti器）作组织块培养，选择性消化抑制成纤维样细胞（FLC）生长；应用有限稀释法纯化CSEC，倒置显微镜下观察CSEC的形态、生长特征；应用细胞角蛋白18、波形蛋白、Brn3．a和Calretinin的免疫细胞化学及透射电镜等进行鉴定。Brdu标记CSEC核DNA观察CSEC有丝分裂活动。结果：培养第2天CSEC从组织块迁移出来，呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态，细胞之间连接紧密，形成单层时呈“铺路石样”外观；FLC呈梭形“鱼群样”包绕CSEC生长，增殖速度快于CSEC。由纯化的CSEC构成的上皮单层可见由成百个CSEC包绕液体形成的dome。CSEC表达毛细胞的特征性标志物，证实培养的CSEC具有毛细胞前体细胞的特征；并通过有丝分裂活动产生新的细胞即毛细胞样细胞。结论：体外培养的CSEC表达毛细胞特征性标志物，具有毛细胞前体细胞的特征。CSEC原代培养体系的建立，为进一步探讨毛细胞再生的分子机制提供了实验条件。     

成年鼠耳蜗听觉细胞自然培养诱导毛细胞样细胞的产生

近年来的研究证实耳毒性药物损伤后的哺乳动物前庭上皮中可见有丝分裂活动以及不成熟毛细胞的出现，许多学者推断哺乳动物前庭中存在毛细胞的前体细胞。而在哺乳动物的耳蜗听觉上皮中是否也存在听觉毛细胞的前体细胞以及听觉毛细胞能否再生仍有争议。本研究对成年鼠耳蜗听觉上皮细胞进行体外培养，试图寻找听觉毛细胞的前体细胞，为治疗蜗性聋及进一步研究提供理论依据。     

miR-182可以促进耳蜗前体细胞分化为毛细胞

目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用血清诱导分化,BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力;myosinⅦa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其是否具有分化为毛细胞的潜能。分别利用miR-182 mimics和siRNA在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182,然后在细胞诱导分化7天后,用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例,用Western-blot检测支持细胞标志分子中Sox2的变化。结果使用miR-182 mimics进行过表达后,耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例显著高于对照组,使用miR-182 siRNA进行低表达后此比例显著低于对照组。Western-blot检测显示,Sox2在miR-182 mimics组较对照组降低,miR-182 siRNA组较对照组增加。结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化,ox2可能是此过程中的靶基因。     

单个耳蜗毛细胞扫描电镜观察

由于扫描电镜能立体观察组织细胞表面结构 ,现已广泛应用于耳蜗组织的研究。但扫描电镜只能从细胞顶部观察 ,难以立体地全面研究其细胞表面结构。本文试图研究一种能扫描单个毛细胞的方法。1　材料与方法1 .1 　 实验动物Sprague Dawley(SD)大鼠 5只 ,2周龄 ,雌雄兼用 ,由上海医科大学实验动物中心提供。1 .2 　 人工外淋巴液配方 (mmol/L)A液 :Na Cl 1 42 ,KCl 5.4,Ca Cl2 1 .3,Mg SO4 0 .9,HEPES 5.0 ,Glucose 5.0 ,1 N Na OH调 p H7.4,4N Na Cl调渗透压 30 0 m Os/L。 B液 :A液去掉 Ca Cl2 、Mg SO4 。 C液 :B液加木瓜蛋…     

体外诱导耳蜗毛细胞研究进展

耳蜗毛细胞是听觉系统的机械感受器,在成年哺乳动物中不能自发再生,因此,耳蜗毛细胞损伤导致的听力损失是永久性的。毛细胞的再生疗法作为听力损失的新型治疗方法广泛受到人们的关注。文中对胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞几个常用干细胞和成纤维细胞体外诱导获得耳蜗毛细胞的研究进展和存在的问题进行总结,并对毛细胞再生疗法的未来发展进行展望。     

锰诱导体外培养耳蜗毛细胞的损伤与凋亡研究

目的探讨锰诱导体外培养耳蜗毛细胞损伤与凋亡的关系。方法将出生3天的新生Sprague Dawley大鼠的耳蜗器官体外培养,将贮存浓度为100m M氯化锰用SFM稀释到终浓度为1m M,3m M,5m M后进行体外染毒处理耳蜗基底膜。应用鬼笔环肽染色特异性显示耳蜗毛细胞的静纤毛,同时用β-Tubulin对神经纤维进行染色,用TUNEL试剂盒;Cleaved caspase-3抗体对耳蜗基底膜进行染色,在激光共聚焦显微镜下分别观察耳蜗基底膜的毛细胞,神经纤维。结果耳蜗基底膜培养24小时,1m M氯化锰对耳蜗毛细胞及神经纤维损伤甚微,差异无统计学意义(P>0.05),内,外毛细胞排列整齐规律,听神经纤维分布均匀,成束排列。最高浓度5m M氯化锰处理24小时后对神经纤维造成明显的损害,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。当浓度逐渐增加,损伤愈加显著并呈浓度依赖性。2m M氯化锰处理,对耳蜗基底膜底转损伤较中转、顶转明显。不同浓度氯化锰处理24小时TUNEL染色阳性细胞随着氯化锰浓度的增加而增多;Cleaved caspase-3染色阳性细胞亦随着氯化锰浓度的增加而增多。结论通过大鼠耳蜗器官体外培养方法,发现氯化锰会造成毛细胞缺失,神经纤维变细变少,而这种损伤的机制与细胞凋亡密切相关。     

耳蜗毛细胞肌动蛋白的结构与功能

本对近年来有关耳蜗毛细胞内肌动蛋白的献进行综述，重点阐述了耳蜗毛细胞内肌动蛋白在毛细胞内的分布、结构特点以及功能意义。     

全耳蜗毛细胞定量分析系统

目的 介绍一种计算机辅助下的全耳蜗毛细胞定量分析系统。方法 选取氨基糖甙类药物损伤、噪声性损伤以及老年性聋动物模型的耳蜗制备全耳蜗基底膜铺片，从蜗尖向蜗底逐个视野依次进行内外毛细胞计数，将采集的数据输入到计算机并用毛细胞定量分析系统制备成耳蜗图。结果 氨基糖甙类药物耳蜗损害模型的耳蜗图显示毛细胞缺损自底回向顶回发展，外毛细胞的损伤比内毛细胞严重；强噪声引起的毛细胞破坏局限在与刺激声频率相对应的基底膜区域；6月龄C57BL／6J小鼠的耳蜗图显示老年性聋的早期损害起始于耳蜗底回的起始端，其中外毛细胞的破坏比内毛细胞严重。结论 耳蜗毛细胞定量分析系统可清晰显示全耳蜗毛细胞在基底膜上不同部位的损失程度和破坏范围，并可对应到基底膜上各个频率敏感部位。将传统的耳蜗铺片与计算机技术相结合制备的耳蜗图，具有全面可靠、简便精确、规范等优点。     

Lesions to cochlear inner hair cells induced by noise

Summary A total of 28 un-anesthetized rabbits of the small chinchilla strain were unilaterally exposed to noise (2–7 kHz, 135 dB SPL in the ear canal). After a follow-up time ranging from 15 minutes to 10 months, the ears were perfused with glutaraldehyde and prepared for analysis by secondary emission electron microscopy and or transmission electron microscopy. The typical finding was a fusion and clumping of inner hair cell (IHC) sensory hairs. In two of the animals, no loss of outer hair cells (OHC) was observed; in several of the others, only a small local loss of OHC was observed in the 2 and 4 kHz regions in spite of extensive IHC abnormality. A frequency map of the rabbit cochlea was obtained by pure tone lesions to OHC. The extent of IHC abnormalities corresponds to the 1–16 kHz region. The findings may provide a basis for the study of the functional relationship between the IHC and OHC.Supported by grants from the Swedish Medical Research Council (14X-04958-05B, 12X-03156-09C), Stifteisen Tysta Skolan, K A Wallenberg Foundation, The Swedish Work Environment Fund (79/80) and The Karolinska Institute fundsPresented at the 17th Workshop on Inner Ear Biology in Stockholm, June 23–25, 1980     

Dynamic changes in microRNA expression during differentiation of rat cochlear progenitor cells in vitro

Objective

Cochlear progenitor cells could be used to explore the cochlea developmental mechanism and for cell replacement therapy in deafness. MicroRNAs are small, noncoding RNAs that could regulate the cell fate of stem cells, as well as cellular proliferation, differentiation and maturation. An expression profile analysis of microRNAs is necessary to understand their complex roles in differentiating cochlear progenitor cells.

Methods

The microRNAs microarray was used to analyze microRNA expression changes while differentiating cochlear progenitor cells. Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to confirm and compare the results of the microarray and to detect the expression pattern of several microRNAs during the differentiation of neural stem cells.

Results

Nearly 100 microRNAs were identified from the microarray. Most showed changes in expression levels as cochlear progenitor cell differentiation progressed. The quantitative real-time polymerase chain reaction result demonstrated that the miR-183 family exhibits cell-specific expression in cochlear progenitor cells compared with neural stem cells.

Conclusions

The temporal regulation of these microRNAs indicated that they might play different roles in differentiating cochlear progenitor cells, and that specific microRNAs might influence the cell fate determination of cochlear progenitor cells.     

转基因诱导新生大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞实验

目的通过转染Hathl基因诱导大鼠耳蜗大上皮嵴细胞（greater epithelial ridge,GER）和小上皮嵴细胞（1esser epithelial ridge,LER）分化为毛细胞样细胞。方法取出生后第l天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分别分离出纯的GER和LER细胞,并转染Hathl基因,培养后做免疫组化染色观察。结果GER和LER体外培养并转染Hathl基因后,免疫组化检测显示肌球蛋白（myosinVIIa）染色阳性,表达毛细胞的特异标记物。提示GER和LER已分化为毛细胞样细胞。结论GER和LER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,转染Hathl后．可分化为毛细胞样细胞。     

E2F2过表达使内耳感觉细胞重新进入细胞周期

目的将调控细胞周期和增殖的E2F2基因导入成年哺乳动物耳蜗中,使其过表达,从而使耳蜗内的终末静止细胞重新进入细胞周期,向可分裂细胞转变,达到实现增加毛细胞数量的目的。方法将人来源的E2F2基因构建到腺病毒载体上,通过圆窗导入耳蜗;全耳蜗铺片、耳蜗切片观察E2F2过表达后耳蜗细胞的形态特点,用BrdU标记及ki67免疫组化方法检测其增殖情况。结果腺病毒携带的E2F2基因通过圆窗导入耳蜗后,能够在耳蜗毛细胞和支持细胞上表达。特别是在螺旋神经节细胞表达更强。转染E2F2基因后,耳蜗内的细胞BrdU标记呈阳性结果,且有ki67表达。结论过表达E2F2有可能使处于终末期的耳蜗细胞重新进入细胞周期,此方法为毛细胞再生研究提供了新的思路。     

荧光下豚鼠听觉离体毛细胞的凋亡改变

目的：探讨离体耳蜗毛细胞的凋亡改变。方法：采用胶原酶制备离体耳蜗毛细胞、0．01％吖啶橙进行荧光染色,荧光显微镜观察凋亡改变。结果：凋亡毛细胞的主要形态特征包括：胞核皱缩;荧光显微镜下凋亡毛细胞呈红色或红黄色荧光,毛细胞形态完整,无胞膜破裂或胞质溢出。结论：离体耳蜗毛细胞的凋亡改变使细胞呈红色或红黄色荧光,胞膜完整。     

人类耳蜗感觉细胞自然培养方法探讨

目的在体外对人类耳蜗感觉细胞进行成功培养。方法参照用于豚鼠的有关技术,选择死亡6 h内的新生儿尸体,取出其耳蜗,采用微分离技术分离耳蜗感觉上皮细胞块并对细胞块酶解,加入可分量的细胞培养液制成含低密度的分离细胞混悬液,分置培养皿中,置培养箱中培养。结果获得了对人类耳蜗感觉细胞进行分离和培养的技术。结论成功分离出耳蜗感觉细胞并使用自制的细胞培养液进行了长期自然培养,为以后进一步研究耳蜗感觉细胞（包括耳蜗干细胞）积累了经验。     

Cytodifferentiation of cochlear hair cells

Cytodifferentiation of a limited number of cochlear hair cells in the mouse starts on the 14th gestational day. One day later, the number of identified hair cells increases considerably. Cytodifferentiation apparently occurs in a gradient from the hair cell surface to the base. First, the irregular microvilli covering the future hair cell surfaces begin to show a regular pattern but are of the same thickness and length as microvilli on supporting cells. Second, a polarization of sensory hairs occurs with a stepwise increase in stereocilia length in the different rows toward the kinocilium. Finally, the cuticle is formed, giving an anchorage for sensory hair rootlets in the hair cell. At birth some hair cells can be found with immature surface morphologic features, e.g., stereocilia of the same length on the entire hair cell surface and lack of a cuticular plate. The onset of hair cell differentiation takes place without morphologic contact with ingrowing nerve fibers.     

Apoptosis of guinea pig cochlear hair cells following chronic aminoglycoside treatment

Although aminoglycosides have been investigated for their cochleotoxicity, it has still not been determined whether apoptosis or necrosis results in cochlear hair cell death following aminoglycoside treatment. To study possible mechanisms of cell death, we used in situ DNA break-labeling to examine guinea pig cochleae affected by kanamycin ototoxicity. Chronic kanamycin treatment induced DNA fragmentation that was detectable in both outer and inner hair cells, suggesting the occurrence of apoptosis. These findings suggest that apoptosis achieves deletion of affected hair cells without disrupting tissue architecture in the organ of Corti. Received: 22 April 1997 / Accepted: 31 July 1997     

Calpain在噪声损害毛细胞中的角色

目的：了解Calpain在噪声损害耳蜗毛细胞中所扮演的角色。方法观察Calpain免疫细胞化学反应产物在噪声损害中的变化。结果正常对照耳蜗样品中未见Calpain活性显示,但噪声损害耳蜗样品中可见外毛细胞底部及其神经末梢区域出现大量的Calpain。结论噪声引起的耳蜗毛细胞破坏可能与Calpain的激活及其降解功能有关。     

大鼠椭圆囊感觉上皮细胞的原代培养及其意义

目的建立大鼠椭圆囊感觉上皮细胞（utricular sensory epithelial cell，USEC）的原代培养体系，为研究毛细胞再生机制提供大量来源一致的细胞。方法取出生1天（postnatal dayl，P1）大鼠的椭圆囊感觉上皮，嗜热菌蛋白酶（thermolysin）消化处理，获得纯椭圆囊感觉上皮。再采用消化法进行原代培养，培养基为DMEM。从第2天开始每日用倒置显微镜观察、照相，对USEC的形态、生长特征进行观察；透射电镜观察；应用细胞角蛋白18及波形蛋白免疫细胞化学方法鉴定USEC来源：应用免疫细胞化学及RT—PCR分别检测毛细胞的特征性标志物calretinin、Brn3．a和AChR α9、myosin Ⅶa mRNA的表达。结果原代培养USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态。细胞之间连接紧密，形成单层时呈“铺路石样”外观，可见由成百个USEC包绕液体而成的dome。原代USEC表达细胞角蛋白，不表达波形蛋白，微绒毛丰富，细胞间连接紧密，提示其上皮起源；表达毛细胞的特征性标志物Bin3．a、calretinin及AchR α9、myosin Ⅶa mRNA，表明培养USEC具有毛细胞前体细胞的特征。结论原代培养的USEC表达毛细胞的特征性标志物，具有毛细胞前体细胞的特征。USEC原代培养体系的建立。为进一步探讨毛细胞再生的机制提供充足的细胞来源。