人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定

目的：探讨从人胎盘组织中分离羊膜间充质干细胞（hAMSCs）。方法：收集剖宫产足月胎儿胎盘,采用组织块贴壁法分离出羊膜问充质干细胞并传代培养,对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察,用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子CD73．APC、CD90-FITC、CIM4．PE、CDl05．Cy5．5和阴性分子CDllb-PE、CDl9．PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE,并采用六孔板法检测细胞增殖情况。结果：hAMSCs的细胞形态呈成纤维状,hAMSCs在培养3-d达到对数增长期,通过流式检测,发现细胞可表达CD73、CD90、CD44和CDl05,未表达CDllb、CDl9、CD34,CD45、HLA-DR。结论：从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

微载体cytodex 3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

目的建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的方法。方法用Percoll梯度离心结合贴壁法分离hMSCs,用微载体cytodex 3培养hMSCs,以普通单层聚苯乙烯(TCPS)培养作对照,用流式细胞仪(FCM)和MTT法对其细胞表型和增殖活性检测。结果①梯度离心结合早期换液是分离hMSCs的较好方法,FCM检测表明hMSCs表面表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1和HLA-DR。hMSCs细胞周期分布显示:G0/G1期(86.4±3.8)%,S G2 M期(13.6±4.2)%;②hMSCs与cytodex 3有良好的相容性,MTT法表明hMSCs在cytodex 3表面悬浮生长时具有比普通单层TCPS培养时更高的数量和增殖活性,FCM分析表明两者的细胞表型和细胞周期分布相同,无显著性差异(P>0.05)。结论微载体cytodex 3培养方法是扩增组织工程种子细胞hMSCs的有效方法。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的探讨兔骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定的方法,比较与人骨髓间充质干细胞表面抗原表达的差异。方法梯度离心法提取兔骨髓中的间充质干细胞,常规贴壁生长,免疫组化和流式细胞的方法检测细胞CD44、CD29、CD34的变化。结果培养的细胞呈纤维状、克隆样生长;免疫组化表明CD29、CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达,流式细胞的结果表明90.26%的细胞表达CD29,89.76%的细胞表达CD44,仅有5.15%的细胞表达CD34。结论兔骨髓间充质干细胞表面抗原的部分表达与人相同,可用于相关的基础研究。     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

脐带血血清分离培养人胎盘间充质干细胞

目的：探讨脐带血清（UCBS）分离、培养人胎盘间充质干细胞（PMSCs）的增殖及分化能力。方法：将 UCBS 处理后用于分离、培养 PMSCs 作为实验组,同体积 FBS 分离、培养 PMSCs 作为对照组,用相差显微镜观察实验组与对照组 PMSCs 的形态、流式细胞仪检测 PMSCs 表面标志、MTT 法检测 PMSCs 的增殖能力。结果：10％ UCBS 的培养液分离纯化的 PMSCs 成梭形、增殖能力强,具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力,高表达CD29、CD44及 CD105,低表达或不表达 CD34、CD45及 HLA-DR;与对照组相比,UCBS 组细胞增殖能力更强。结论：脐带血清能分离、培养及扩增 PMSCs,培养的 PMSCs 的增殖能力及分化潜能好于 FBS。     

新生兔骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的：新生兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养方法,从各方面鉴定体外培养BMSCs的生物学特性。方法：采用贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续细胞的形态学观察。从形态学特征、表面标志物及其具有的向骨、脂肪分化的功能等多方面经行综合鉴定。结果：原代BMSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、呈放射状排列。传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速;可向成骨细胞、脂肪细胞分化。结论：贴壁筛选法可成功分离和培养新生兔的BMSCs,BMSCs能向成骨细胞、脂肪细胞分化,可以作为组织工程中种子细胞的来源。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法取无恶性血液病的32~65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1 mL/孔)进行培养,48 h后更换新鲜培养液,以后每3 d换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果成人骨髓接种后24 h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6~15 d细胞进入快速增殖期,一般培养20~25 d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10~15 d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论用密度为1.077 g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外优化条件的研究

目的通过比较5种不同体外培养人骨髓问充质干细胞（hMSCs）条件，找到一种能在质和量上均能满足需要的体外培养条件。方法使用Percoll-Paque液（1．073g／ml）分离人骨髓血，采用DMEM＋15%的小牛血清、人体白蛋白、人血清、脐带血清及MesenCult培养基，在相同培养条件下，动态观察hMSCs的生长状况、细胞数量变化，通过流式细胞仪检测细胞的纯化状况。结果5种培养条件在一定时相内均能获得较为纯化的hMSCs，但在生长速度和纯化率上存在一定的差异。结论Mesen Cult是一种较为优秀的hMSCs培养基．胎儿脐带血清培养也能在短期内获得足量纯化的hMSCs．人血清的使用还需要做进一步的研究。     

新生兔骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

目的:新生兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养方法,从各方面鉴定体外培养BMSCs的生物学特性。方法:采用贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续细胞的形态学观察。从形态学特征、表面标志物及其具有的向骨、脂肪分化的功能等多方面经行综合鉴定。结果:原代BMSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、呈放射状排列。传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速;可向成骨细胞、脂肪细胞分化。结论:贴壁筛选法可成功分离和培养新生兔的BMSCs,BMSCs能向成骨细胞、脂肪细胞分化,可以作为组织工程中种子细胞的来源。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

人脐血间充质干细胞的分离与纯化

目的:探讨人脐血间充质干细胞(MSC)的培养纯化条件。方法:比较不同的梯度离心速度及时间、接种密度、首次换液时间、不同培养基对脐血中的MSC分离及原代培养过程的影响,以流式细胞仪对优化条件下培养的MSC进行细胞周期分析,并对细胞表面标志进行检测。结果:在其他条件不变的情况下,以1 000g×15 min的梯度离心速度及时间分离脐血为最宜,5×106/mL是脐血MSC培养的适宜接种密度,首次换液时间7 d。优化条件下培养的MSC传至3代时,几乎全部强表达CD29、CD44。结论:建立了一种优化的人脐血MSC分离纯化方法。     

兔骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的建立兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分离、培养和鉴定的方法.方法采用贴壁法培养扩增兔BMSCs,通过形态学观察及流式细胞仪鉴定证实得到的细胞为BMSCs.结果倒置相差显微镜可观察到大量梭形、漩涡状贴壁细胞,流式细胞仪鉴定可见所培养的间充质干细胞高表达其表面标记物CD44,低表达CD14和CD45造血细胞表面标志物,初步证实所培养的细胞为兔BMSCs.结论骨髓贴壁分离法培养间充质干细胞是一种方便快捷、经济有效的培养方式.此种细胞培养方法能够得到较纯化的BMSCs.     

骨髓间充质千细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

目的体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）,观察MSC在肝移植受体内的定居能力。方法直接贴壁法培养大鼠MSC,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化,鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC,由门静脉注入肝移植受体,取肝组织冰冻切片,观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功分离培养MSC,并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5d,可在体外传代20代以上,具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100％。荧光显微镜观察。可见MSC定位于移植肝内。结论直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高,生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。     

人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化

【目的】 探究一种高效稳定分离、扩增人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的方法。【方法】取材脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法（12例）和酶序贯消化法（8例）来分离、提取hUC-MSCs,比较两种方法分离hUC-MSCs的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM（LG-DMEM）完全培养基和LD-Mesen培养基（MesenPro RSTM与LG-DMEM的混合培养基）分别培养hUC-MSCs,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】 酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%（12/12）和12.5%（1/8）,二者相比有显著统计学差异（P=1.03×10-4）,前者原代培养平均时间为（14.17±1.14）d,获得细胞（1.30±0.14）×106个。2×105个hUC-MSCs用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,二者有显著统计学差异（P=1.38×10-8)。hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】 酶联合消化Wharton’s Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSCs,效率明显优于传统方法。     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

低氧抑制人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的 探讨低氧对人间充质干细胞(hMSCs)分化为成骨细胞的影响,为骨组织工程学提供实验依据.方法 根据培养氧浓度及培养液类型随机分为4组:正常氧组(n)(20%O2 DMEM-LG),低氧组(h)(1%O2WDMEM-LG),正常氧成骨诱导组(nos)(20%O2 条件培养液)及低氧成骨诱导(hos)(1%O2 条件培养液).观察细胞形态变化,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,定量分析ALP、I型胶原蛋白(COLIA2)、骨钙素(OC)及骨粘连蛋白(BSP)mRNA表达情况,钙结节使用茜素红染色.结果 与nos组相比,n、h及hos组hMSCs生长形态改变不明显,并且不受条件培养液的影响.hos组hMSCs的ALP活性逐渐增高,但明显低于nos组,两者差异有统计学意义(P<0.01);培养4周后,与其它组相比,nos组的hMSCs可见到明显的染成红色的钙结节及钙盐沉积.定量RT-PCR检测,nos组hMSCs的ALP、OC、COLIA2及BSP mRNA表达量从7 d时开始明显增加,ALP 14 d后达到峰值,随后活性开始降低,OC、COL1A2及BSPmRNA继续增高,hos组ALP及BSP mRNA 14 d后开始增加,但明显低于nos组(均P<0.05).结论 低氧环境在体外抑制hMSCs成骨细胞分化,延迟hMSCs成骨.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

人睾丸支持细胞的分离培养及鉴定

目的:建立人胚胎睾丸支持细胞体外分离,纯化及培养的方法,并进行鉴定。方法:取胎龄13~28周的胚胎睾丸,采用两步酶消化,添加特定培养基,培养过程中纯化睾丸支持细胞,并用免疫荧光及RT-PCR技术对培养细胞进行鉴定。结果:通过检测阶段特异性标记物M IS提示胚胎睾丸支持细胞占培养细胞总数的90%以上,经RT-PCR及免疫荧光检测所培养细胞具有分泌产生SCF的能力。结论:在本研究建立的培养体系下细胞可稳定传代,经鉴定为高纯度的睾丸支持细胞,并维持了其体内生物学活性。     

小鼠骨髓间质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定

 【目的】 建立小鼠骨髓间质干细胞(MSC)体外培养?纯化?扩增方法,并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定?【方法】 取3～18月雄性C57BL/6J小鼠(共48只)骨髓细胞,贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,观察纯化后的细胞形态,对3?10?20代的MSC进行细胞生长曲线绘制;并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞的分化能力?【结果】 小鼠MSC在体外可以诱导成成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞?MSC连续传代培养达30代以上,细胞的形态?抗原表达无改变,并保持多向分化潜能?【结论】 该方法获得的MSC具有高度增殖?多向分化潜能?生物学特性稳定的特点?