VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究

目的:构建pcDNA3.1/VEGF165质粒及联合脱蛋白骨基因治疗早期股骨头缺血性坏死.方法:将含人VEGF165全长cDNA序列的克隆载体pUC18/VEGF165与pcDNA3.1( )载体构建成重组真核表达质粒pcDNA3.1/VEGF165;69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组.第一组,将脱蛋白骨复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内;第二组植入DPB;第三组仅在股骨头内钻一隧道.股骨头标本术后3天,1,2,4,8和16周获取.RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达,Western blot检测VEGF165蛋白的表达,组织形态学分析血管发生和股骨头修复.结果:成功构建pcDNA3.1/VEGF165;第一组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周.血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异呈显著性(P＜0.01).结论:VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成.脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础.     

不同应力对坏死股骨头自身修复过程中血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨不同应力刺激下犬股骨头缺血性坏死后自身修复过程中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA的表达变化及意义.方法 健康比格犬24只,通过液氮冷冻法制成犬股骨头坏死,并对坏死股骨头施以不同的应力,根据承受应力环境不同分为低高及中应力组(B、C、D组).对照组(A组)股骨头不做处理.分别于术后4、8周处死实验犬,取股骨头标本,行HE染色观察组织病理学改变,免疫组化染色及定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测VEGF蛋白及mRNA的表达变化.结果 HE染色提示:D组关节软骨、骨小梁的结构和形态较B、C组改善;免疫组化提示:D组股骨头内VEGF蛋白面积积光度在术后第4、8周显著高于其他各组;RT-PCR检测最示:D组股骨头VEGF mRNA的表达率在术后第4、8周高于其他各组,第8周高于第4周(均P＜0.05).结论适当的应力刺激能有效促进犬股骨头骨组织中VEGF蛋白及mRNA的表达,进而有助于促进血管的新生和软骨下骨的重建,可能有利于坏死股骨头的修复.     

bFGF复合PDPB修复股骨头缺损的实验研究

目的:模拟临床上治疗股骨头坏死的开窗法的手术过程制备缺损模型,并植入bFGF/PDPB(碱性成纤维细胞生长因子+部分脱蛋白骨),以探bFGF对股骨头缺损的治疗作用.方法:成年健康新西兰白兔24只,切开关节囊,在头颈交界处开窗,建立缺损模型.48侧股骨头随机分为3组:A组植入bFGF/PDPB;B组植入PDPB;C组为空白对照.术后2、4、8周处死动物,制备墨汁灌注标本,样本行X线及病理学观察,骨钙含量测定,并进行图像分析.结果:X线、病理学观察及图像分析结果表明:A组在术后2、4周和8周股骨头缺损区修复组织无论在血管生成方面还是在新生骨组织的质量方…     

bFGF复合PDPB修复股骨头缺损的实验研究(摘要)

目的：模拟临床上治疗股骨头坏死的开窗法的手术过程制备缺损模型。并植入bFGF／PDPB（碱性成纤维细胞生长因子＋部分脱蛋白骨），以探bFGF对股骨头缺损的治疗作用．方法：成年健康新西兰白兔24只。切开关节囊。在头颈交界处开窗。建立缺损模型．48侧股骨头随机分为3组：A组植入bFGF／PDPB；B组植入PDPB；C组为空白对照．术后2、4、8周处死动物。制备墨汁灌注标本。样本行X线及病理学观察。骨钙含量测定．并进行图像分析.     

血管内皮细胞生长因子体外修饰骨髓基质干细胞关节镜下回植治疗兔股骨头坏死的研究

目的 检测rAAV-2-hVEGF-165转染骨髓基质干细胞后的基因表达,研究髓芯减压关节镜监视下hVEGF基因转染骨髓基质干细胞在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值.方法 制备rAAV-2-hVEGF-165,将病毒以感染被率(MOI)为1×10~5v.g./cell转染兔骨髓基质干细胞,应用腺相关病毒介导绿荧光蛋白转染兔骨髓基质干细胞检测转染情况.应用RT-PCR和免疫印迹检测转染BMSCs外源hVEGF基因的转录与表达,得出最佳的转染时间.关节镜监视并对坏死骨清除后植入骨髓基质干细胞,术后2、4、8周分别对各组兔股骨头行X线分析,生物力学分析,切片血管计数并行免疫组化检查,观察疗效.结果 rAAV-2-hVEGF-165转染的兔骨髓基质干细胞可有效表达hVEGF-165,RT-PCR和免疫印迹检测可见转染MSCs中外源hVEGF基因的转录与表达.转染后48 h即可有表达,10 d时表达最强.免疫组化检测发现植入转染的骨髓基质干细胞2周后出现阳性表达,8周后强阳性表达.生物力学分析显示植入转染细胞组股骨头强度接近正常股骨头.结论 hVEGF-165基因转染的兔骨髓基质干细胞可有效表达具有生物活性的hVEGF-165蛋白.通过关节镜监视可以彻底清除死骨,使hVEGF-165基因修饰的骨髓基质干细胞准确的回植入股骨头坏死处,可使股骨头缺血性坏死的修复加强.回植入兔股骨头的hVEGF-165基因可有效表达.     

异种脱蛋白骨修复长骨大段骨缺损实验研究

目的研究改良法制备的异种脱蛋白骨（deproteinated bone,DPB）作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段缺损24周后新生骨的生物力学变化。方法山羊18只,采用完全随机设计法分为正常骨对照组、自体骨组和实验组,每组6只,在自体骨组和实验组每只山羊右侧胫骨中下段造成胫骨总长度20％骨膜和骨缺损,正常骨对照组不截骨,其余2组分别在缺损处植入自体骨、DPB＋自体MSCs＋rhBMP2,采用半环槽外固定,术后24周取手术侧胫骨进行生物力学检测。结果术后24周,正常骨对照组、自体骨组和实验组新骨生物力学相比无统计学差异（P〉0．05）。结论改良法制备的异种DPB复合物作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段缺损形成的新骨,其生物力学与正常骨对照组、自体骨组相当,可作为骨移植材料试应用于临床。     

人股骨头制作的脱钙骨基质和脱蛋白骨成骨诱导活性比较

目的比较人无菌性坏死股骨头制作的脱钙骨基质（DBM）和脱蛋白骨（DPB）的体外成骨诱导活性。方法将人股骨头制作成的DBM和DPB与人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）复合培养,并以单层细胞为对照组。检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）和钙离子（Ca2＋）的浓度。结果两种材料均表现出成骨诱导活性,DBM材料组的ALP、OC和Ca2＋浓度均明显高于DPB组和对照组,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论DBM和DPB均具有成骨诱导活性,且DBM的成骨诱导活性更强。     

Brdu标记VECs和ADSCs构建组织工程骨体内增殖研究

目的研究联合培养的血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)和脂肪干细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)构建组织工程骨,在体内增殖和分化情况.方法 (1)用猪椎骨制备部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白修饰制成部分脱蛋白生物骨,电镜扫描生物骨表面情况;(2)选用大鼠脐血单个核细胞诱导分化的血管内皮细胞和大鼠脂肪干细胞,体外1:1浓度联合培养;(3)分别用Brdu标记的血管内皮细胞、脂肪干细胞和联合培养细胞体外复合部分脱蛋白生物骨,体外培养6 d后植于SD大鼠两侧股部肌袋处;2周、4周、8周、12周取材,硬组织切片中Brdu抗体免疫荧光染色,观察植入的种子细胞在机体内的增殖分化情况.结果 (1)猪椎骨制备部分脱蛋白骨孔隙分布均匀,由大量的羟基磷灰石纤维编织而成;部分脱蛋白生物骨表面可见大量颗粒状蛋白结晶;(2)Brdu免疫荧光染色各组植入种子细胞开始呈分散状分布,细胞逐渐增殖呈巢状,血管内皮细胞组和联合培养细胞组植入内皮细胞增殖形成大量新生血管;未标记Brdu空白组未见阳性细胞出现.结论组织工程骨植入种子细胞在体内能大量增殖,参与新组织和新生血管的形成.     

VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究

目的以hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞移植治疗兔激素性股骨头坏死模型,通过影像学观察、病理学及免疫组织化学检查等方法评价疗效。方法使用马血清与醋酸泼尼松龙制备兔激素性股骨头缺血性坏死动物模型后分为4组,分别进行以下治疗：A组（不作任何处理）;B组（髓心减压＋自体骨移植）;C组（髓心减压＋骨髓间充质干细胞＋自体骨移植）;D组（髓心减压＋Ad-VEGF165转染骨髓间充质干细胞＋白体骨移植）。术后3周处死行病理学、免疫组织化学检查及Western Blot检测股骨头内VEGF的表达,比较各组间的差异。结果D组在软骨下血管、VEGF阳性面积百分比、股骨头内VEGF的相对浓度均高于其他各组;在VEGF平均灰度值、空骨陷窝率低于其他各组,且各组间差异有统计学意义。结论转染了Ad—VEGF165的骨髓间充质干细胞在宿主股骨头局部可以表达VEGF蛋白,且较单纯的骨髓间充质干细胞移植表达的强度更高,对激素性股骨头坏死进行早期治疗具有确切疗效。     

三七总皂苷对激素性股骨头缺血性坏死模型兔骨组织血管内皮生长因子和骨形态形成蛋白-2mRNA表达的影响

目的 探讨三七总皂苷对激素性股骨头缺血性坏死模型兔骨组织中血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态形成蛋白-2(BMP2) mRNA的影响.方法 运用改进马血清联合甲强龙造模方法建立兔激素性股骨头缺血性坏死模型.将造模成功的模型兔分为生理盐水组、复方骨肽组、三七总皂苷组各10只,分别于股骨头局部注入生理盐水、复方骨肽及三七总皂苷,连续治疗4周.采用实时荧光定量PCR检测各组兔骨组织VEGF及BMP-2的mRNA表达量.结果 复方骨肽组和三七总皂苷组的BMP2 mRNA的表达量均高于生理盐水组(P＜0.05),三七总皂苷组与复方骨肽组的BMP2 mRNA的表达量比较,差异无统计学意义(P＞0.05);复方骨肽组和三七总皂苷组VEGF mRNA的表达量高于生理盐水组(P＜0.05),且三七总皂苷组高于骨肽组(P＜0.05).结论 三七总皂苷对提高激素性股骨头缺血性坏死模型兔的VEGF mRNA和BMP2mRNA具有正向影响.     

Vascular endothelial growth factor gene transfection to enhance the repair of avascular necrosis of the femoral head of rabbit

Avascularnecrosisofthefemoralheadisadebilitatingdiseasethatusuallyleadstodestructionofthehipjointandincreasingmusculoskeletalmorbidityinyoungandmiddleagedpatients Totaljointreplacementiscommonlyusedtotreatdisablingsecondaryosteoarthrosis Althoughthemostrecentimprovementsintotalhipreplacementmaydecreasefailure,thepatientsareusuallyyoungandcurrenthipprostheseswon’tfunctionwellfortheremaininglifeexpectancyofthesepatients Thus,it’snecessarytodelayoreliminatetheneedforhipreplacementbytreatingthis…     

BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR GENE TRANSFECTION TO ENHANCE THE REPAIR OF AVASCULAR NECROSIS OF THE FEMORAL HEAD

A VASCULAR necrosis of the femoral head usually leads to destruction of the hip joint, increasing musculoskeletal morbidity in young and middle aged patients. Total joint replacement is commonly used to treat disabling secondary osteoarthrosis. Although most recent improvements in total hip replacement may decrease the failure, patients are usually young and the current hip prothesis function would not fulfill purpose for the remaining life ex-pectancy for these patients. So it is necessary…     

Experimental Study of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Therapy for Avascular Necrosis of the Femoral Head

Avascularnecrosisofthefemoralheadisanin creasingcauseofmusculoskeletalmorbidityinyoungandmiddleagedpersons It’sadebilitatingdiseasethatusuallyleadstodestructionofthehipjoint To taljointreplacementiscommonlyusedtotreatdis ablingsecondaryosteoarthrosis Althoughthemostrecentimprovementsintotalhipreplacementmayde creasethefailure ,thepatientsareusuallyyoungandthecurrenthipprothesiswouldn’tfunctionwellfortheremaininglifeexpectancyforthesepatients Forthisreason ,it’snecessarytodelayoreliminatethe…     

Ad-huVEGF121基因转染对兔坏死股骨头血流的影响

目的探讨一种治疗股骨头缺血坏死的新方法.方法重组腺病毒Ad-hVEGF121注射入坏死的股骨头,应用RT-PCR和免疫组织化学技术检测VEGF121的表达,观察股骨头内新生血管数量,用SPECY技术观察坏死股骨头的动脉灌注情况.结果转染后的股骨头内VEGF121表达增高,新生血管数量增多,SPECT观察发现坏死股骨头血流量明显增加.结论转染VEGF1:1基因可以增加坏死股骨头新生血管数量和血流量.     

纤维蛋白胶复合BMP治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究

【目的】通过局部植入骨形态发生蛋白（BMP），探索股骨头缺血性坏死早期治疗的新方法。【方法】连续肌肉注射地塞米松制造股骨头缺血性坏死（ANFH）的动物模型，将实验动物分为A，B，C3组，于股骨头下钻孔，在A组和B组分别将BMP／FS或单纯的BMP植入孔道，C组作为空白对照。通过大体观察、MRI检查、钙含量测定和组织学观察，研究复合材料对ANFH的修复作用。【结果】MRI观察显示，植入BMP／FS8周后原骨缺损孔道消失，被新生骨所取代。单纯植入BMP可见少量新生骨，空白对照组内仍为纤维组织。A组钙含量显著高于另外两组。组织形态学观察可见A组术后8周原骨缺损区基本消失，有大量相对较成熟的骨小梁及板状骨并存。B组骨缺损区明显缩小，周边亦有少量骨小梁存在，新生毛细血管少见，缺损区有大量纤维组织填充。C组术后8周缺损区缩小，周边有少量新骨形成并逐渐形成骨壁，中心部仍为纤维组织，无骨组织充填。【结论】BMP在缺血坏死的股骨头内可诱导新骨形成，与FS复合后，BMP诱导新骨形成的质量和数量均明显提高，局部植入BMP／FS对ANFH具有良好的修复作用。     

VEGF-165基因修饰的骨髓间充质干细胞移植修复犬股骨头坏死

目的研究hVEGF-165基因转染的犬骨髓间充质干细胞移植修复自体股骨头坏死的效果。方法用股骨颈截骨后克氏针再固定的方法建立犬股骨头坏死的动物模型,分为转基因间充质干细胞移植组、单纯间充质干细胞移植组和未治疗组,每组9只动物(18侧髋关节)。脂质体法将hVEGF-165基因转染进入骨髓间充质干细胞。造模后10周经大转子将细胞植入股骨头坏死区,转基因间充质干细胞和未转基因干细胞随机植入同一动物的左侧或右侧后肢。细胞移植后第2、8和12周取股骨头标本进行骨小梁定量分析,结合X线和同位素断层扫描分析3组间成骨修复的差别,并比较第12周时各组标本中截骨平面以上的血管数。结果①造模手术后10周,手术侧股骨颈骨折已愈合,但股骨头均出现典型的坏死。②骨小梁定量分析提示,在每一个时间点各组的成骨修复的差别有统计学意义:转基因间充质干细胞移植组的成骨修复好于单纯干细胞移植,未治疗组最差。X线和SPECT的表现与此相符。③12周时,转基因间充质干细胞移植组中血管数量最多,间充质干细胞移植组与未治疗组的血管数量没有统计差别。结论与未转基因的间充质干细胞移植相比,转染hVEGF-165基因后的间充质干细胞移植能够增加股骨头坏死区血管...     

血管化组织工程骨修复兔股骨干骨缺损

目的 观察血管化组织工程骨修复兔股骨干骨缺损的成骨特点,初步探讨其修复骨缺损的机制.方法 32只新西兰大白兔均制备左侧股骨干15 mm段性骨缺损模型,随机分为两组,实验组:兔自体骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙(β-TCP)构建组织工程骨同时联合血管柬植入骨缺损;对照组:单纯植入组织工程骨.于术后2、4、8、12周行组织学观察骨形成与改建情况,同时行免疫组织化学,荧光定量聚合酶链反应,免疫印迹检测修复骨段内血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 组织学观察显示随着时间发展,两组成骨量均逐渐增加,从4周起实验组骨修复优于对照组;实验组各时间点组织工程骨中VEGF的表达量高于对照组,随着时间延长,VEGF呈先增高后降低趋势,在4周时表达量最大.结论 血管化组织工程骨可有效促进兔股骨缺损的修复,植入血管束能促进VEGF的表达,VEGF是促进骨再生和血管再生的重要因子.