DC瘤苗制备及其在肿瘤免疫治疗中的应用

树突状细胞(DC)是目前功能最强的抗原递呈细胞，能刺激初始型T细胞增殖，激发机体免疫应答。研究发现肿瘤患者体内DC数量明显减少，其表型及功能明显缺陷。近年来DC培养及DC瘤苗的研究取得较大进展，DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的新方法。     

恶性肿瘤的瘤苗免疫治疗

恶性肿瘤的瘤苗免疫治疗，是指呈经各种基因修饰后的肿瘤细胞在体外制成瘤苗，经致死性剂量照射后，重新接种于患者体内，使逃避免疫监视的肿瘤细胞可以被免疫系统识别，从而诱导机体产生针对肿瘤细胞的主动的、特异的免疫反应。目前，瘤苗免疫治疗已有很多成功的动物模型，人体的临床试验也取得了肯定的疗效。但如何进一步提高免疫效果，仍面临着许多问题和挑战。     

阳离子脂质体介导的小鼠白细胞介素2基因修饰肝癌细胞瘤苗

目的 研究阳离了脂质体介导的小鼠白细胞介素2基因修饰肝癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用。方法 利用阳离子脂质体Transfectam,将携带小鼠白细胞介素2（IL－2）基因的真核表达南粒VR1110,导入小鼠肝癌细胞H22;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测转染后经放射线照射、末经放射线照射和冻融后的细胞培养上清液中白细胞介素2的浓度;并研究转染后经放射线照射而制成的瘤苗的抗肿瘤效应。结果 转染后经放射线照射和末经放射线照射的H22细胞均持续分泌IL－2达30天以上;转染细胞在冻融后也能分泌IL－2;制备的瘤苗对小鼠肝癌模型肿瘤的生长有明显的抑制作用,并能明显提高荷瘤小鼠的生存率。结论 阳离了脂质体介导的小鼠细胞介素2基因转染后,能在肝癌细胞中有效表达,所制备的瘤苗可诱导有效的抗肿瘤效应。     

脂质体瘤苗特异性主动免疫的实验治疗

用同系肿瘤相关抗原脂质体瘤苗免疫ＩＣＲ小鼠后分别接种１×１０５肝癌Ｈ２２细胞或艾氏腹水瘤细胞。实验显示：未免疫的动物全部死亡，免疫动物部分（１０％～３０％）存活。死于肿瘤的动物其平均存活时间，免疫组要比对照组明显延长（Ｐ＜０．０１）。     

肝癌（H22）固化瘤苗的免疫实验研究

应用高温固化结合手术切除治疗肝癌曾作介绍.随访发现高温免疫远位效应.为研究此种治疗方法与免疫的关系.应用小鼠移植性肝癌H_(22)在65℃/5min射频条件下制备成固化瘤苗.用该瘤苗免疫小鼠(BALB/C)发现能特异性主动免疫抗同源H_(22)3×10~8癌细胞的攻击,抗癌率为86.6%,未出现瘤苗促癌生长现象.与对照组鼠比较,具有显著细胞免疫效应.认为固化瘤苗的实验有临床应用研究价值.     

恶性肿瘤的瘤苗免疫治疗

恶性肿瘤的瘤苗免疫治疗，是指应用肿瘤细胞或经各种基因修饰后的肿瘤细胞在体外制成瘤苗，经致死性剂量照射后，重新接种于患者体内，使逃避免疫监视的肿瘤细胞可以被免疫系统识别，从而诱导机体产生针对肿瘤细胞的主动的、特异性的免疫反应。目前，瘤苗免疫治疗已有很多成功的动物模型，人体的临床试验也取得了肯定的疗效。但如何进一步提高免疫效果，仍面临着许多问题和挑战。     

瘤苗特异性主动免疫治疗及其机制的实验研究

围绕中药莪米及其有效成分疗，榄香烯的抗癌作用与原理的研究，用多种小鼠可移植性瘤株，比较系统，深入地研究了中药(莪术油，β-榄香烯等)、化学药品(MMC，戊二醛等)，放射能（^65Co、X线等)及／或病毒(痘苗病毒、新城鸡瘟病毒)等处理的肿瘤细胞疫苗或其膜组分(Mfr)的主动免疫防治效应及其规律和机制，获得了明显的可重复的阳性结果，解决了有关瘤苗制备、保存和使用方法等一系列问题。     

SEA 及MDP 对骨肉瘤融合细胞瘤苗作用的影响

 目的 检测SEA和MDP对骨肉瘤融合细胞瘤苗作用的影响。方法 使用³H-TdR掺入法和⁵¹Cr释放法测定SEA对骨肉瘤融合细胞瘤苗所诱导的T细胞增殖和CTL杀伤活性的影响。在骨肉瘤动物模型上检测SEA和MDP与骨肉瘤融合细胞瘤苗同时使用的治疗效果。结果 SEA可显著增强骨肉瘤融合细胞瘤苗所诱导的T细胞增殖和CTL细胞杀伤活性。动物实验结果表明，SEA和MDP与骨肉瘤融合细胞瘤苗共同使用时，可显著降低荷瘤鼠的平均瘤重及肺转移发生率。结论 SEA和MDP可作为免疫促进剂与骨肉瘤融合细胞瘤苗共同使用，加强其抗肿瘤免疫的治疗效果。     

LncRNA-HEIH/EZH2通路在肝癌中的作用及血清学表达意义

摘 要：［目的］ 探讨long non-coding RNA-HEIH/enhancer of zeste homolog 2(lnc RNA-HEIH/EZH2)通路在肝癌中的作用及血清学表达中的意义。［方法］ 选择确诊为肝癌的早期患者30例、晚期患者30例以及健康志愿者30例,收集其临床资料及血清学样本。运用qPCR方法,检测其血清中的lncRNA-HEIH基因表达量。利用脂质体包裹lncRNA-HEIH反义寡核苷酸片段转染肝癌细胞,构建lncRNA-HEIH基因沉默的BEL-7402肝癌细胞模型,运用qPCR方法检测lncRNA-HEIH基因及EZH2基因在lncRNA-HEIH基因沉默后的表达。运用Western Blotting对肝癌细胞中EZH2蛋白进行半定量检测。运用CCK-8法对 lncRNA-HEIH基因沉默前后肝癌细胞的增殖活性进行检测。［结果］ 早期和晚期肝癌患者血清中lncRNA-HEIH基因及EZH2基因的表达量均高于健康人,差异有统计学意义（P＜0.05）。当lncRNA-HEIH基因沉默后,EZH2基因表达下降,肝癌细胞的增殖活性明显降低。［结论］ LncRNA-HEIH基因可作为肝癌发生发展的潜在的血清学生物标志物。     

甲胎蛋白基因转染树突状细胞瘤苗对诱发性小鼠肝癌发生发展的免疫抑制作用

目的 构建小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因转染的树突状细胞(DC)瘤苗,评价其在C57BL/6J小鼠自然肝癌诱发过程中的免疫保护作用.方法 诱导、扩增DC.将表达mAFP的重组腺病毒颗粒转染DC,检测转染前后DC细胞表面分子MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CDl8a(LFA)、CD54(ICAM)、CD80(B7.1)和CD86(B7.2)等的变化.80只C57BL/6J雄性小鼠随机分为单纯接种DC组、接种转mAFP基因DC(pAdBM5-mAFP-DC)组、单纯接种重组质粒(pAdBM5-mAFP)组和正常对照组,每组20只.实验组在每只小鼠的左肋部注射5×105个细胞,连续免疫3 d,以后每7 d接种疫苗1次,继续免疫4次;正常对照组仅注射0.1 ml PBS.在接种免疫的同时,给以二乙基亚硝胺(DEN)、四氯化碳(CCl4)和乙醇联合诱癌.诱癌20周后处死小鼠,检查成瘤情况,并对肝脏标本进行组织病理学检查.结果成功构建了转基因pAdBM5-mAFP-DC瘤苗;mAFP基因转染后的DC表面高表达MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD18a、CD54、CD80和CD86等共刺激分子,其分子表达率分别为69.3%、41.0%、42.1%、63.2%、39.4%和38.6%,与转染前差异有统计学意义(P＜0.05).单纯接种DC组、pAdBM5-mAFPDC组、pAdBM5.mAFP组和正常对照组的肝癌发生率分别为65.0%、25.0%、70.0%和75.0%,pAdBM5-mAFP-DC组与其他组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 pAdBM5-mAFP-DC瘤苗免疫自然诱癌的C57BL/6J小鼠,可降低肝癌的发生率,对肝癌的发生有免疫保护作用.     

Enhanced anti-tumor immunity generated by Rituximab-coated tumor cell vaccine

Rituximab is a chimeric monoclonal antibody against CD20, and has been used to treat malignant tumors derived from B cell. We designed a tumor cell vaccine modified by Rituximab, and evaluated anti-tumor effect in human CD20 gene transfected mice tumor model in vivo, and in human CTLs induction by mixed lymphocyte tumor cell culture in vitro. The results demonstrated that the Rituximab-coated tumor cell vaccine had a significant therapeutic effect against tumor pulmonary metastasis formation. Antibody depletion experiments showed CD8+ T Cells were essential for the anti-tumor effect but not NK cells. Capture rate of tumor cells by DCs, which were detected by flow cytometry, was increased by adding Rituximab. The tumor specific cytolysis could be induced by Rituximab-coated tumor cell in human in vitro assay. This therapeutic strategy provides a simple way to potentialize CTLs function to combat cancer and may promote more clinical consideration in immunotherapy for tumors. Rituximab-coated tumor cell vaccine also expanded the clinical Rituximab applications.     

树突状细胞与肾癌融合细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫

目的探讨自体树突状细胞(DC)与肾癌融合细胞疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答。方法利用肿瘤细胞纯化技术,从手术切除的肾癌组织中分离出高纯度的肾癌细胞,用10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640进行原代培养。分离外周血单核细胞(PBMCs),在含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白细胞介素4(rhIL-4)的培养条件下,诱导分化为DC。用细胞融合技术将DC与肾癌细胞融合制备DC与肾癌融合细胞疫苗。用流式细胞仪检测肾癌细胞、DC和融合细胞的表型;用噻唑盐(MTT)比色法检测融合细胞刺激自体T细胞的增殖能力,乳酸脱氢酶(LDH)释放的细胞毒实验检测融合细胞刺激的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的杀瘤活性。结果DC高表达主要组织相融性复合体(MHC)Ⅰ类分子、MHCⅡ类分子和共刺激分子(CD86,CD80);原代肾癌细胞高表达一种高分子量的糖蛋白(MUC-1);自体DC与肾癌融合细胞疫苗同时表达肾癌细胞和DC细胞的表面抗原,并能有效刺激自体T细胞增殖,诱导产生的CTLs对自体肾癌细胞具有显著的杀伤活性。结论自体DC与肾癌融合细胞疫苗能诱导特异性抗自体肾癌细胞的免疫应答,为自体DC与肾癌融合细胞疫苗在治疗肾癌的临床应用中提供了实验依据。     

半抗原DNP修饰自体肿瘤疫苗治疗晚期恶性黑色素瘤的临床研究

目的 探讨半抗原二硝基氟苯（dinitrophenyl,DNP）修饰自体肿瘤疫苗在晚期恶性黑色素瘤治疗中的作用。方法 84例Ⅲ期或Ⅳ期可切除恶性黑色素瘤患者随机分为半抗原DNP修饰瘤苗组和半抗原DNP未修饰瘤苗组,每组42例,分别采用半抗原DNP修饰的自体肿瘤疫苗和半抗原DNP未修饰的自体瘤苗联合化疗进行治疗,采用流式细胞技术检测两组患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）数量及淋巴细胞亚群的变化,观察迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity,DTH）及随访生存情况。结果 治疗后半抗原DNP修饰瘤苗组患者CD4＋-IFN-γPE、CD8＋-IFN-γPE淋巴细胞亚群较治疗前及半抗原DNP未修饰瘤苗组明显升高（P均〈0.05）,而CD4＋CD25＋Treg数量减少（P〈0.05）,半抗原DNP未修饰瘤苗组治疗前后无明显变化（P〉0.05）;半抗原DNP修饰瘤苗组患者较半抗原DNP未修饰瘤苗组DTH明显增强,硬结明显增大,两组DTH达到阳性结果（≥5 mm）的百分比分别为94.6%和45.0%（P〈0.05）。半抗原DNP修饰瘤苗组患者1年、2年和3年生存率分别为95.0%、73.0%和65.5%,总生存率（overall survival,OS）为79.3%,无疾病生存率（disease free survival,DFS）为81.1%;半抗原DNP未修饰瘤苗组患者1年、2年和3年生存率分别为90.1%、59.0%和43.5%,OS为64.2%,DFS为74.0%,两组患者生存时间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 半抗原DNP修饰的自体瘤苗可增强恶性黑色素瘤患者特异性细胞介导的免疫反应,抑制机体免疫耐受,从而延长患者生存时间。     

树突状细胞融合瘤苗的制备及其在肿瘤免疫治疗中的应用

树突状细胞（DC）融合瘤苗的制备主要包括DC体外诱导扩增及肿瘤细胞体外培养、诱导融合、瘤苗纯化等流程。在黑色素瘤、胃癌、肾癌等肿瘤的动物实验及临床前期试验中融合瘤苗表现出良好的抗肿瘤免疫效果。     

树突状细胞与胃癌免疫治疗的研究进展

树突状细胞（DC）是机体重要的专职抗原提呈细胞,参与多种生理病理过程,其数量与功能改变与肿瘤的发生发展密切相关。在胃癌组织中,DC的数量与成熟度的降低使肿瘤易于进展与转移,并影响患者预后。DC经体外培养、刺激成熟和负载肿瘤抗原后回输患者体内,可诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应,发挥抗肿瘤作用。以DC为基础的肿瘤免疫治疗已显示出良好的临床应用前景,有望成为肿瘤治疗体系中一种新手段。     

PML-RARα-hIL-2DNA疫苗免疫BALB／c小鼠后胸腺初始T细胞水平变化

目的了解PML-RARα-hIL-2基因疫苗免疫小鼠后胸腺初始（naive）T细胞变化情况。方法利用实时定量PCR检测小鼠胸腺组织DNA中T细胞受体删除DNA环（TRECs）的水平，从而评价小鼠胸腺中naiveT细胞含量。结果利用PML-RARα-hIL-2DNA疫苗免疫小鼠后胸腺中所含的TRECs拷贝数明显高于单个基因疫苗PML-RARα或hIL-2组及对照组。结论所构建的PML-RARα-hIL-2双表达质粒可诱导小鼠胸腺产生naive T细胞数量增加，可能与产生更强的细胞免疫应答有关。     

负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗联合CIK治疗晚期肾癌的临床观察--附10例报告

背景与目的:肾癌的主要治疗手段是手术,但晚期肾癌术后复发率高,加上肾癌对化疗和放疗不敏感,因此,晚期肾癌预后不佳,需要寻找新的更有效的治疗方法。本研究通过负载自体肿瘤细胞裂解物的树突细胞(dendriticcells,DC)疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells,CIK)治疗10例晚期肾癌,观察近期的临床疗效,免疫学反应及副作用。方法:分离患者外周血单核细胞,体外经GM-CSF和IL-4诱导产生DC细胞,并负载自体肿瘤细胞裂解物;T淋巴细胞经IFN-γ、IL-2、CD3单抗、IL-1α体外诱导产生CIK细胞。所有患者在切除原发病灶后,接受每周一次的皮内DC疫苗注射治疗,至少8次治疗;CIK细胞过继细胞免疫治疗,每2周一次,至少接受4次治疗。临床疗效和免疫学反应分别通过影象学检查,外周血T淋巴细胞亚群改变和迟发性超敏(delayed-typehypersensitivity,DTH)反应进行评估。结果:(1)4例有可评价病灶的患者中1例部分缓解(PR),2例疾病稳定(SD),1例进展(PD);6例没有可评价病灶的患者中1例PD,1例失访,另外4例未见疾病进展。随访时间6～20个月(中位时间11个月)。(2)与治疗前比较,治疗2个月后患者CD3 、CD4 、CD4 /CD8 、CD56 明显升高(P<0.05)。(3)包括PR患者在内的6例患者DTH反应呈现阳性。(4)除一过性的发热、畏寒外没有其它不良反应出现。结论:负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗联合CIK细胞治疗晚期肾癌有一定的近期临床疗效,能诱导出特异的抗肾癌免疫反应,并且有良好的耐受性。     

BLC肿瘤细胞疫苗与顺铂联合抗肿瘤作用的实验研究

背景与目的:趋化因子是一类小分子蛋白质,是引发细胞迁移的主要介质,研究表明,趋化因子可提供较强的稳定抗肿瘤免疫。本研究拟用BLC基因修饰的肿瘤细胞疫苗与顺铂联合作用肿瘤细胞,以探讨其抗肿瘤效应与机理。方法:首先将重组质粒pcDNA-BLC转染到Colon26小鼠结肠癌细胞株或LL/2小鼠肺癌细胞株,建立稳定表达BLC的转化肿瘤细胞株(简称Tc细胞)。作为对照,质粒pcDNA(+)也稳定转染到Colon26或LL/2肿瘤细胞。用Tc肿瘤细胞建立小鼠动物模型,同时以稳定转染质粒pcDNA3.1(+)的肿瘤细胞(简称为Pc细胞)和未转染质粒的肿瘤细胞(简称为Nc细胞)为对照建立小鼠模型。将5×105个Tc细胞、Pc细胞和Nc细胞分别接种于BALB/c小鼠(Colon26细胞小鼠模型)或C57BL/6小鼠(LL/2细胞小鼠模型)右侧胁部皮下,每组20只,每组再随机分为2小组(即Tc-A、Tc-B,Pc-A、Pc-B和Nc-A、Nc-B组),每小组10只。治疗方案:以A组(包括Tc-A、Pc-A和Nc-A)为化疗组,分别加顺铂2mg/kg,腹腔内注射,每周1次,连续2次;而B组(包括Tc-B、Pc-B和Nc-B)为生理盐水对照组,每只小鼠腹腔相应地注射0.1ml生理盐水。观察小鼠肿瘤生长情况、存活期及不良反应,并进行肿瘤组织形态学观察和肿瘤细胞凋亡分析。结果:联合治疗组Tc-A显示明确抗肿瘤作用,小鼠肿瘤生长受到明显抑制,     

SHP2作为抗肿瘤治疗靶点的价值及其在肿瘤免疫治疗中的应用

包含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)是目前唯一被证实具有促癌作用的细胞质蛋白酪氨酸磷酸酶,在多种恶性肿瘤中高表达。SHP2可以通过介导受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)下游的RAS/ERK、PI3K/Akt和JAK/STAT等信号通路促进肿瘤发生发展,影响肿瘤预后。同时,SHP2参与调控PD-1/PD-L1、CTLA-4、BLTA和TIGIT等免疫检查点信号通路,对于肿瘤微环境中各种免疫细胞都有重要的调节作用。靶向SHP2不仅可以通过抑制RTK下游信号通路,还可以通过改善免疫微环境治疗恶性肿瘤。因此,SHP2具有免疫与靶向双重治疗肿瘤的功能,作为抗肿瘤治疗的靶点展现出极高的潜能与价值。     

树突状细胞局部免疫抗瘤作用的初步研究

目的：探讨树突状细胞（ＤＣ）瘤内注射的局部免疫方式对小鼠Ｈ２２肿瘤的治疗效果。方法：体外诱导生成树突状细胞,经Ｈ２２肿瘤裂解抗原致敏,实验分为对照组、ＤＣ组和ＤＣ＋ＣｐＧ-ＯＤＮ组,分别与Ｔ细胞共培养,收获的Ｔ细胞与肿瘤细胞共培养,观察其对肿瘤细胞的杀伤。体内试验：ＢＡＬＢ／ｃ小鼠皮下接种Ｈ２２肿瘤细胞制作成荷瘤鼠,第４天时进行局部瘤内免疫治疗,分为３组：生理盐水组、ＤＣ组和ＤＣ＋ＣｐＧ-ＯＤＮ组,免疫治疗１０天后处死小鼠,观察其治疗小鼠Ｈ２２肿瘤的效果。结果：体外实验中,对照组、ＤＣ组和ＤＣ＋ＣｐＧ-ＯＤＮ组的肿瘤杀伤率分别为（１０.８０±３.２７）％、（３８.２６±５.６０）％和（４２.６６±９.００）％,后两组杀伤率均高于对照组（Ｐ＜０.０１）;体内实验中,生理盐水组、ＤＣ组和ＤＣ＋ＣｐＧ-ＯＤＮ组的平均瘤重（ｇ）分别为１.８０４±０.４２２、１.２１６±０.３３５和０.７３３±０.１９１（Ｐ＜０.０１）。结论：ＤＣ瘤苗局部瘤内注射可抑制小鼠Ｈ２２肿瘤的生长,联合应用非甲基化ＣｐＧ-ＯＤＮ可以明显提高抑瘤效果。