十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶AduGST-1基因的克隆和重组表达

目的克隆十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶（GST）AduGST-1基因,并在大肠埃希菌中表达获得重组AduGST-1。方法设计特异引物,以十二肠钩虫成虫cDNA为模板,通过PCR扩增AduGST-1基因。将获得的AduGST-1编码序列克隆至原核表达载体pETHF,构建重组表达质粒pETHF/AduGST-1。重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达、Ni亲和层析分离纯化重组AduGST-1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达及纯化情况。结果成功扩增到AduGST-1全长编码序列,并登记到GenBank（accession no.JQ812812）。AduGST-1编码序列长度为624bp,编码307个氨基酸残基。成功构建了重组表达质粒pETHF/AduGST-1,在BL21（DE3）中表达并纯化了重组AduGST-1。结论首次报道从十二指肠钩虫中分离到GST基因,该基因可在大肠埃希菌中高效表达,并分离纯化了重组GST蛋白,为进一步研究AduGST-1功能与应用奠定了基础。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

CTX—M一3型超广谱β-内酰胺酶原核表达条件的研究

目的探讨重组质粒pET一28a（＋）／CTX—M一3分别在大肠埃希菌ER2566和BL21（DE3）中进行原核表达的最佳条件。方法分别在不同的宿主菌、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度中诱导pET．28a（＋）／CTX—M一3融合表达载体,目的产物经SDS—PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件。结果表达载体的最佳诱导条件是重组质粒在BE21（DE3）中18℃诱导24h,IPTG终浓度为0．8mmol／L;表达载体在最佳条件下表达时,目的蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的33％。结论获得pET一28a（＋）／CTX—M一3在大肠埃希菌中表达CTX—M一3型超广谱β一内酰胺酶（extended—spectrumB—lactamase,ESBLs）蛋白的最佳条件,为此酶的大量纯化奠定了基础。     

人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus, HAstV）非结构蛋白nsP1a／1,免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白,使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS?PAGE）和二噻啉甲酸（BCA）实验对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的nsP1a／1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD 大鼠获得多抗血清,用 ELISA 测定抗体效价、 Western 印迹检测抗体特异性。结果nsP1a／1?pET28a原核表达载体构建成功,将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）细菌中诱导表达了重组蛋白,免疫大鼠获得的多抗血清几何平均效价达到1∶406374。结论本实验成功地运用原核表达系统表达并鉴定了人星状体病毒非结构蛋白nsP1a／1,为进一步研究人星状病毒的复制及病毒感染的临床诊断奠定基础。     

粉尘螨第五组主要变应原（Der f5）的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第五组变应原（Dermatophagoides farinae,Derf5）基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法提取活粉尘螨总RNA,扩增Derf5片段,PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a（＋）连接,转化入大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果,Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性。结果构建了重组质粒pMD18-Derf5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符,纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性。结论获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白,初步鉴定了该蛋白的免疫原性。     

牛IgG2Fc受体（boFcγ2R）胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体，并在E.coli BL21（DE3）中表达。方法：提取健康成年牛的白细胞总RNA，经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段，并将其克隆到载体pGEM-TEasy，经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切鉴定及序列测定后，再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，构建重组质粒pET-2R，转化E.coli BL21（DE3）经LPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得682bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21（DE3）后，经IPTG诱导，表达出相对分子质量（Mr）约为30000的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21（DE3）的胞质中，Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合。结论：成功地构建了原核表达载体pET-2R，并表达出重组蛋白。为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达情况。方法超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法（geneSOEing）剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST—Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α（＋）,构建重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,转化人大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β—D．半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS—PAGE和Westem—blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET32α（＋）中,SDS—PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000Mr的重组蛋白．与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22％：Western—blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原一件     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a( )-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a( )-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。     

HCV非结构蛋白质5A基因全长和高免疫源区的表达及免疫活性检测

目的探讨HCV非结构蛋白质5A（NS5A）基因全长和高免疫源区的表达并比较其检测灵敏度。方法以含HCV全基因组的质粒pBR^tm／HCV-3011（1b型）为模板，采用PCR方法扩增出NS5A全长基因（以下用NS5AL代替）和高免疫源区基因（以下用NS5AS代替），与pET-32a载体相连接构建重组表达载体pET-NS5AL和pET-NS5AS，分别转化E.coli Rosetta（DE3）pLysS和BL21（DE3）感受态细胞，经异丙幕-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，蛋白质印迹法检测其表达，镍螯合（Ni2^＋-NTA）琼脂糖亲和层析柱纯化重组NS5AL和NS5AS蛋白，最后通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性并对其榆测灵敏度进行比较。结果SDS—PAGE鉴定与蛋白质印迹验证结果表明，重组NS5AL和NS5AS蛋白均得到很好地表达；纯化的重组NS5AL和NS5AS蛋白浓度分别为0．146和0．426mg／ml，纯度均〉96％；ELISA检测结果表明，重组NS5AL和NS5AS蛋白均具有较好的免疫活性，且重组NS5AL蛋白的检测灵敏度明显高于NS5AS。结论成功地表达出重组NS5AL和NS5AS蛋白，均具有较高的免疫活性，将有助于提高HCV临床检测的灵敏度。     

HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究     

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。     

丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体,并在大肠杆菌TG1中进行表达,用以检测丙肝患者体内抗体,并制备抗血清。方法提取患者血清中的HCVRNA,并进行基因分型。取鉴定为HCV1b型的病毒,用RT-PCR扩增HCVF蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEM-T载体中,测序正确后,用EcoRI、BamHI双酶切后,再插入表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GST-F蛋白。用亲和层析法纯化GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GST-F蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-F融合蛋白。应用Westernblot方法检测证实,用纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GST-F蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体,82例呈阳性。结论通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高,免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%,与国外的报道接近,说明在HCV感染的自然病程中有F蛋白的产生,为研究HCVF蛋白及与HCV相关疾病的诊断和治疗提供了条件。     

HCV E1基因序列的原核高效表达及表达产物的初步应用

目的 在原核表达系统中对HCV E1基因进行克隆和高效表达,并初步探讨表达产物在抗－HCV筛选中的作用。方法 通过RT－PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCV E1片段,并在扩增用的引物中引入克隆所需的酶切位点,克隆产物经Xba I和EcoR I酶切后,在T4DNA连接酶的作用下克降人经同样双酶切的原核表达载体PMS－31b中,并用此连接产物转化大肠埃杀菌POP2136,挑取具有氨苄抗性的菌东扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定,鉴定出的阳性菌经42℃诱导后用SDS－PAGE检查其表达状况,并用Western blot鉴定表达产物有特异性,同时用初步纯化的表达产物用ELISA法检测病人血清。结果 经Sma I酶切后PCR产物被切成144bp和356bp的两个片段,在具有氨苄抗性的菌中提取的质粒经Sma I和Xba I酶切后产生了一356bp的片段;42℃诱导后在SDS－PAGE中出现了一条相对分子质量为31000的条带,其表达量约为17％,经Western blot鉴定后在该处出现了阳性信号;ELISA实验显示在抗HCV阳性的血清中的阳性率约为29．8％（26／90）,而在抗HCV阴性的 血清中其阳性率约为3．9％（3／76）。结论 通过RT－PCR方法将HCV E1基因从HCV RNA阳性的血清标本中调出,构建了HCV E1的原核表达载体－PMS－E1,其表达量为17％,表达产物具有良好的特异性,有望应用于抗HCV的检测中。     

菌体内可溶性表达重组THANK蛋白的免疫调节活性分析

目的：构建含有人THANK基因的表达载体，诱导其在大肠杆菌中可溶性表达，并对表达的THANK蛋白的免疫调节性进行检测。方法：从含有全长，THANKcDNA的pMD18-THANK质粒中克隆THANK的胞外区片段，并将其亚克隆至原核表达载体pET-11a中，筛选阳性重组质粒pET-THANK,以IPTG诱导其可溶性表达，并以SDS－PAGE和Westen blot检测进行分析。表达的蛋白初步纯后，分析其对B、T细胞的免疫调节活性。结果：PCR扩增出了THANK胸包区cDNA片段，SDSPAGE和Western分析产重组的pET-THANK质粒可表达出THANK蛋白。可溶性THANK重组蛋白可共刺激B、T细胞的增生，并可诱导活化T细胞的凋亡。结论：本实验成功地将THANK胞外区片段在大肠杆菌中进行表达，表达的蛋白具有免疫调节活性。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2的原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠睾丸特异表达基因Biot2的原核表达载体,表达pQE30-Biot2融合蛋白。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增Biot2基因片段,并将其克隆入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-Biot2。经限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliXL-Blue,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测。结果构建pQE30-Biot2重组原核表达质粒,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约17700处出现了1条蛋白条带,该表达蛋白具有与His-tag单克隆抗体(mAb)特异性的结合能力。结论成功地构建了Biot2基因的原核表达载体,并表达出pQE30-Biot2重组蛋白,为下一步制备多克隆抗体和蛋白功能的深入研究奠定了实验基础。     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。