Ezrin基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建能有效下调Ezrin蛋白表达的短发夹状RNA(Small hairpin RNA,shRNA)表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于预防性治疗骨肉瘤肺转移的可行性.方法:依据小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)靶序列的设计原则,以Ezrin蛋白编码基因Villin2为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pGenesil-1质粒中,转化后进行酶切鉴定和DNA序列测定.将构建的载体用脂质体介导转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞株,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞Ezrin蛋白在mRNA和蛋白水平的表达.结果:成功构建2个针对Ezrin蛋白的shRNA表达载体;其转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞后,细胞Ezrin蛋白表达在mRNA及蛋白水平上的表达均显著下降.结论:Ezrin蛋白的shRNA表达载体能显著抑制大鼠骨肉瘤UMR106细胞Ezrin蛋白的表达,本研究为预防性治疗骨肉瘤肺转移的实验奠定基础.     

大鼠骨肉瘤肺转移模型的建立

目的:构建大鼠骨肉瘤的肺转移模型,为骨肉瘤肺转移的机理及治疗研究奠定基础.方法:RPMI1640培养基体外扩增UMR106细胞(大鼠骨肉瘤细胞株),分别用无血清培养基和鼠尾胶稀释成1×107cells/ml混悬液,原位注入3周龄SD大鼠胫骨近端骨髓腔内,每只0.2ml.观察成瘤情况,死后尸检肺转灶数目,X线检查骨质变化,组织学检查确定肿瘤性质.结果:两组大鼠原位成瘤率及肺转移率均达100%.X线检查示明显骨质破坏和瘤骨形成,组织学检查见肿瘤样骨基质形成,符合临床骨肉瘤各项特征.培养基组和鼠尾胶组肿瘤形成时间分别为(10.0±1.65)天和(17.8±0.87)天,差异有显著性(P＜0.0001);肺转移灶数目分别为(155.25±36.63)个和(91.5±29.56)个,差异有显著性(P＜0.0001);大鼠生存时间分别为(21.4±6.67)天和(40.6±9.52)天,差异也有显著性(P＜0.0001).结论:UMR106细胞原位移植SD大鼠建立骨肉瘤模型方法简单、重复性好、实验周期短、肺转移率100%,是研究骨肉瘤肺转移的理想动物模型.无血清培养基稀释法肿瘤形成及肺转移出现时间早,实验周期快,可用于骨肉瘤肺转移机制的研究.鼠尾胶稀释法肿瘤形成时间相对较晚,生存时间长,肺转移数目稍少,适用于骨肉瘤治疗方法的研究.     

乳腺癌及其转移灶Ezrin、RECK与Kiss-1蛋白表达和意义

目的 观察乳腺癌及其转移灶Ezrin、RECK与Kiss-1蛋白表达情况.方法 运用免疫组织化学法对乳腺癌患者乳腺癌组织及其转移灶中Ezrin、RECK与Kiss-1蛋白表达情况进行观察.结果 与对照组相比,不伴转移的乳腺癌肿瘤组织内Ezrin蛋白表达显著增高(P＜0.05),伴转移者乳腺癌肿瘤组织内Ezrin蛋白表达更高(P＜0.05),淋巴转移灶中也可见Ezrin蛋白表达(P＜0.05);与对照组相比,不伴转移的乳腺癌肿瘤组织内RECK及Kiss-1蛋白表达显著降低(P＜0.05),伴转移者乳腺癌肿瘤组织内RECK及Kiss-1蛋白表达量更低(P＜0.05),淋巴转移灶中也可见RECK及Kiss-1蛋白降低(P＜0.05).结论 Ezrin蛋白表达增高,RECK及Kiss-1蛋白表达降低可能可以作为乳腺癌转移的生物学标志.     

RNA干扰Ezrin体外对胃癌AGS细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨膜-细胞骨架联接蛋白Ezrin对胃癌细胞株AGS侵袭和迁移能力的影响.方法 针对人Villin2基因(Ezrin编码基因)设计发夹式RNA(shRNA).合成后克隆入载体pGCsileneer,扩增并中量提取质粒,应用脂质体Lipofectamine 2000转染进AGS细胞.采用RT-PCR和Western印迹检测Ezrin的表达.shRNA转染AGS细胞并行G418筛选,传代扩增.结果 shRNA-Ezrin对Ezrin表达抑制作用明显,稳定转染细胞Ezrin下调率达93%.侵袭实验AGSEzrin 细胞的跨膜数为(27.67±4.50),与对照组(125.50±8.33)比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论 Ezrin在人胃癌细胞侵袭迁移过程中发挥重要作用,可能成为胃癌基因治疗的一个新靶点.     

Ezrin蛋白与E-cadherin在食管鳞癌中的联合检测及其意义

目的：探讨食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中Ezrin蛋白与E-cadherin的表达及其与肿瘤侵袭和转移的关系.方法：以30例癌旁正常黏膜组织作对照,应用免疫组织化学SP法检测76例ESCC组织标本中Ezrin蛋白与E-cadherin的表达.结果：ESCC组织中Ezrin蛋白与E-cadherin的异常表达率分别为78.95％和59.21％;而癌旁正常黏膜组织中异常表达率分别为26.67％和6.67％,两项指标差异均有统计学意义（P＜0.01）.Ezrin蛋白异常表达在ESCC淋巴结转移和组织分化程度间差异有统计学意义（P ＜0.05和P＜0.01）,E-cadherin异常表达在ESCC组织的浸润深度、ESCC细胞的分化程度和淋巴结转移间差异均有统计学意义（P ＜0.05 ～P ＜0.01）.Ezrin蛋白与E-cadherin在ESCC中的异常表达呈正相关关系（P＜0.05）.E-cadherin异常表达组Ezrin蛋白表达阳性率显著高于E-cadherin正常表达患者（P＜0.05）.两者同时异常表达的40例中淋巴结转移高达70％,而两者同时正常表达的11例均无淋巴结转移,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论：Ezrin蛋白与E-cadherin在ESCC组织中均异常表达,且呈正相关.联合检测Ezrin蛋白和E-cadherin的表达有助于综合判断ESCC的浸润、转移及预后.     

核糖核酸酶抑制因子过表达抑制B16细胞的侵袭和转移

目的 构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响.方法 提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B16细胞以后,经G418筛选出阳性克隆.根据转染质粒不同分别命名为B16细胞组(未转染组)、空质粒对照组(pIRES2 -EGFP组)和实验组(pIRES2-EGFP-RI组).RT-PCR检测B16细胞中RI mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫化学检测RI蛋白水平的表达;HE染色观察细胞形态的改变,黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及E-cadherin的表达;建立C57BL/6小鼠肺转移模型,观察肺上肿瘤转移灶的变化.结果 酶切和测序结果证明重组质粒构建成功,实验组细胞RI的mRNA和蛋白的表达较B16细胞组和空质粒对照组显著升高(P＜0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染pIRES2-EGFP-RI质粒的实验组细胞的黏附、迁移及侵袭能力明显降低(P＜0.05);与两对照组相比,实验组细胞MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低,nm23-H1和E-cadherin的表达水平明显升高(P＜0.05);动物实验结果显示与对照组相比,实验组的肺转移灶明显减少.结论 成功构建的RI真核表达质粒能升高RI基因及蛋白水平的表达,显著抑制了B16细胞的转移和侵袭能力.     

Ezrin蛋白在胃癌增殖侵袭过程中的作用及其机制初探

目的 分析Ezrin蛋白与胃癌患者临床病理参数之间的关系并探讨其预后价值,初步探讨Ezrin蛋白在胃癌增殖侵袭中的作用机制。 方法 收集无腹膜转移的胃癌组织206例、腹膜转移灶癌组织34例及癌旁组织54例的石蜡标本,采用免疫组织化学方法检测Ezrin蛋白和CD44v6的表达情况;同时收集新鲜胃癌组织及其癌旁组织16例,采用Western-blot方法检测Ezrin蛋白的表达情况。应用细胞功能学实验及RNA干扰技术研究Ezrin蛋白在胃癌侵袭过程中的作用,分析Ezrin蛋白与CD44v6的相关性。 结果 Ezrin蛋白强阳性表达率胃癌组织明显高于癌旁组织,腹膜转移灶癌组织高于原发胃癌组织（均为P＜0.05）。在16例新鲜胃癌组织中,Ezrin蛋白相对表达强度明显高于邻近癌旁组织（P＜0.05）。细胞功能实验显示,Ezrin蛋白表达下调组细胞的生长速率胃癌组织明显受到抑制（P＜0.05）,细胞侵袭能力均明显降低（P＜0.05）。Ezrin蛋白高表达与患者的淋巴结转移显著相关（P＜0.05）;Ezrin蛋白强阳性表达的患者5年生存率明显低于弱阳性表达的患者（P＜0.05）。癌旁组织中CD44v6呈低表达,而在胃癌组织中呈高表达,而且CD44v6表达与Ezrin蛋白呈显著正相关（P＜0.05）。 结论 Ezrin蛋白在胃癌中的表达上调,下调Ezrin蛋白能显著抑制细胞的增殖和侵袭能力;Ezrin与胃癌淋巴结转移及患者预后显著相关;Ezrin蛋白可能通过CD44v6影响胃癌增殖侵袭过程。     

骨骼肌转移瘤的罕见性及骨骼肌微血管内皮细胞粘附分子意义的研究

目的 :建立恶性肿瘤细胞经血循环向骨骼肌运行的动物模型 ,观察骨骼肌转移瘤罕见性现象 ,并进一步探讨骨骼肌微血管内皮细胞粘附分子 ( VCAM- 1)的意义。方法 :Wistar大鼠 60只 ,随机分成实验组与对照组。实验组经髂动脉注入 Walker2 5 6癌肉瘤单细胞悬液 ( 10 4) ,对照组经尾静脉注入同一瘤细胞 ( 10 6) ,两组分别于 2h、 1d、 7d、 14 d各处死 6只 ,余下 6只自然死亡 ,观察比较肺内、大腿骨骼肌内肿瘤形成情况及微血管内皮细胞VCAM- 1表达情况。结果 :实验组注入瘤细胞后 ,第 7天在大腿骨骼肌微血管周围见瘤细胞团 ( 3只 ) ,肌组织内无转移灶形成 ,部分鼠见骨骼肌旁软组织内有转移灶形成 ;对照组注入瘤细胞后肺内 7d形成肿瘤灶 ,14 d及自然死亡者 10 0 %形成广泛肺转移灶 (共 17只 ) ,两组比较差异有显著意义 ( P<0 .0 0 1)。实验组大腿骨骼肌微血管内皮VCAM- 1阳性率在注瘤 d7以后显著上升 ,且实验组大腿骨骼肌与对照组肺微血管内皮细胞 VCAM- 1阳性率无显著差异 ( P=0 .5 )。结论 :临床上广泛存在的恶性肿瘤骨骼肌转移罕见性 ,可在动物模型中观察到。骨骼肌微血管内皮细胞 VCAM- 1的表达 ,不能解释骨骼肌转移瘤罕见性     

Smad7基因转染对肺癌细胞生长的影响

目的:初步探讨Smad7基因对肺癌细胞生长的影响.方法:设实验组和对照组.实验组以携带Smad7cDNA的重组腺病毒载体Ad-Smad7转染A549细胞,对照组以空腺病毒载体转染A549细胞.转染后,2组培养基中分别加入TGFβ1继续培养.观察2组A549细胞培养12 d后的克隆形成率,培养第1 d、3 d、5 d、7 d的存活细胞数和培养第7 d的细胞周期.结果:实验组细胞生长速率高于对照组(P＜0.05);实验组克隆形成率(34±7)%高于对照组的(13±3)%(t=10.674,P＜0.01);实验组G0/G1期细胞比例0.67±0.16,低于对照组的0.79±0.11(t=4.836,P＜0.05);S期细胞比例0.19±0.02,高于对照组的0.06±0.01(t=15.357,P＜0.01).结论:Smad7参与了肺癌细胞内的TGFβ信号通路,它可以阻断TGFβ对肺癌细胞的生长抑制作用.     

2007～2009年铜陵市人民医院产科抗生素应用分析

目的了解产科抗生素的应用情况并评价其合理性以加强临床使用的管理。方法随机抽查铜陵市人民医院2007～2009年产科出院患者病历中的抗生素使用情况,进行回顾性的调查统计分析。结果抗生素使用率达67%,头孢类药物是主要种类,以单独用药情况最多;多数品种DUI接近1。结论该院产科抗生素使用基本合理,但尚须建立有效的监管制度,控制过度使用。     

2005年汕头市登革热定点监测结果分析

目的 通过定点监测为汕头市登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。方法收集监测点的登革热疫情、人群抗体水平和媒介伊蚊等监测资料，用EPI2002软件统计分析。结果2005年汕头市无登革热疫情，抗登革热病毒IgG、IgM阳性率低，伊蚊幼虫孳生密度高峰在6、8、9、10月份，低谷在4、7、11月份，孳生情况随着月平均降水量、平均气温变化而变化；孳生场所以农村、暂时性容器为主。结论汕头市有登革热流行的自然、社会环境条件，人群普遍对登革热易感，8～10月是发动爱国卫生运动，清除伊蚊孳生地，预防、控制登革热流行的适当时机。     

广东高州市2005年医疗机构消毒质量监测分析

目的评价辖区内医疗机构消毒灭菌质量，督促各医疗单位提高消毒灭菌效果，防止医源性感染的发生。方法对辖区内的医疗单位已消毒或灭菌的用品进行抽样检测，将检测结果进行统计学分析。结果这次采集使用中消毒液、无菌器械、物体表面、手术室空气和医务人员手共3556份，检测达卫生标准2955份，符合率为83、10％，不同样品检测达卫生标准百分率依次为97．37％、95．56％、86．25％、75．41％和62、49％。结论高州市医疗机构消毒灭菌质量用卫生指标评价，卫生站的符合卫生标准率低于医院，手术室空气和医务人员手的监测合格率低于使用中消毒液和无菌器械。     

湛江市2007年登革热监测结果

目的分析湛江市2007年登革热监测结果,为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策提供科学依据。方法收集监测点的登革热疫情、布雷图指数、人群抗体水平和媒介伊蚊等监测资料,用EPI2002软件统计分析。结果2007年湛江市暴发2起登革热疫情,发病205例,男97例,女108例;抗登革热病毒IgG阳性率低,伊蚊幼虫孳生密度高峰在9月份,低谷在6-8月份,阳性容器以永久性容器为主。结论湛江市有登革热流行的自然、社会环境条件,人群普遍对登革热易感,8-9月是发动爱国卫生运动,清除伊蚊孳生地,预防、控制登革热流行的适当时机。     

2005年广西流动人口疟疾监测结果分析

目的了解广西流动人员疟疾流行现状,进而提出针对性防治措施。方法收集全区网络直报疫情资料和各级疾病预防控制机构疟疾监测数据进行分析。结果2005年广西流动人口发热病人平均疟原虫阳性率为0·33%。80·62%的病人为本地居民外出到疟疾流行区务工感染所致。以从事护林/砍伐比例最高,占44·19%。结论加强返乡流动人口疟疾监测是巩固广西疟疾防治的关键所在。     

惠州市车间空气中有毒物检测结果分析

目的 了解惠州市电子、五金、电镀等企业生产车间中有毒物污染情况，以便提出有效的预防措施。方法根据中华人民共和国国家标准中气相色谱法、原子吸收分光光度法、分光光度法对车间空气中有毒物质进行检测。结果2003～2004年共检测车间空气样品3625份，舍格3511份，总合格率为96．8％。其中锰尘舍格率最低，为82．2％；其次是三氯乙烯91．0％，氰化氢93．4％，甲苯97．1％，硫酸97．2％，铅烟98．2％，正己烷99．2％。苯99．3％，二甲苯99．6％，其他合格率为100％。结论惠州市部分电子、五金、电镀企业车间空气中有毒物的浓度较高，应改善生产车间的通风设施，做好工人的个人防护。     

食品中氯霉素测定方法的应用研究

目的探讨ELISA检测法检测食品中氯霉素的可行性。方法采用国际上先进的ELISA检测法和酶标读数仪定量检测，并与高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（HPLC—MS／MS）比较。结果氯霉素含量为0．05～0．20ug／kg之间，CV％为2．5％～5％，回收率为85．0％～110．0％，标准曲线r=-0．992～-0．999。结论ELISA法具有灵敏度高，干扰少，测定步骤简便、快速。操作安全，设备投资少，测定结果准确可靠。     

广东省2007年部分地区儿童麻疹免疫水平监测结果分析

目的了解广东地区儿童麻疹免疫水平,客观评价人群麻疹免疫状况,为调整策略并改进工作提供依据。方法采取分层整群抽样法抽取南海、盐田、饶平、乳源、德庆、遂溪6个县4个年龄组1376名儿童,对其麻疹抗体水平进行检测。结果6个地区麻疹IgG抗体总阳性率为96．9％,麻疹IgG抗体总保护率为80．2％,总抗体几何平均浓度（GMC）为1515mIU／ml;不同地区儿童麻疹抗体阳性率、保护率和抗体几何平均浓度（GMC）均有显著性差异;年龄别儿童麻疹抗体阳性率差异无显著性,但麻疹保护率和抗体几何平均浓度（GMC）存在显著性差异;外地与本地儿童麻疹抗体阳性率、保护率和抗体几何平均浓度（GMC）均显示无显著性差异。结论结果显示调查地区抗体总阳性率维持高水平,但珠江三角洲经济发达地区常规免疫工作质量要好于非珠江三角洲经济欠发达地区;麻疹复种工作可有效减少免疫空白儿童,维持人群麻疹高免疫水平;居住时间较长的流动儿童可以获得高的麻疹免疫水平,结合麻疹发病情况,需重点关注居住时间较短的流动儿童免疫状况。     

湖南侗族嘴部活体观测

目的　探讨湖南侗族成年人嘴部的形态特征 ,为体质人类学研究积累资料。方法　用活体观测方法对 2 64例成年侗族人嘴部进行活体研究。结果　得出了湖南侗族嘴部 3项观察值和 6项测量值 ,以及口裂高、宽指数及其分型。结论　湖南侗族嘴部有其独特的特征。     

显色培养基在检测食品中沙门菌的应用研究

目的考核显色培养基对沙门菌的检测效果，以新型快速检测方法。方法按国标（GB4789．4—2003）程序比较几种培养基检测食品中沙门菌的效果。结果以CHROMagar沙门菌显色培养基、HKM沙门菌显色培养基与传统平板DHL对测试菌株和实际样品检测可以达到相近的检测限和灵敏度。HKM沙门菌显色培养基对某些沙门菌的检出灵敏度比CHROMagar沙门菌显色培养基更高。结论用显色培养基检测沙门菌是一种新快速途径，可大大提高检测效率。