降钙素基因相关肽基因体外转染人脐静脉内皮细胞

目的 观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ）基因对人脐静脉内皮细胞的作用，探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 构建含有ＣＧＲＰｃＤＮＡ的逆转录病毒载体，体外转染人脐静脉内皮细胞，用ＲＴ－ＰＣＲ及放射免疫法分析检测基因表达水平，应用细胞计数及流式细胞仪观察ＣＧＲＰ基因对内皮细胞生长的     

新生儿窒息血浆内皮素及降钙素基因相关肽的变化

目的：探讨新生儿窒息血浆内皮素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ，ＥＴ）及降钙素基因相关肽（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ）的变化。方法：对２４例足月新生儿窒息患儿及１８例对照新生儿，用放射免疫学方法测定出生后第１天和第５天血浆ＥＴ１及ＣＧＲＰ浓度。结果：生后第１天窒息患儿血浆ＥＴ１及ＣＧＲＰ水平均显著高于对照组；生后第５天患病组二者水平显著下降。实验组第１、５天血浆ＥＴ１及ＣＧＲＰ呈正相关性。结论：新生儿窒息血浆ＥＴ生成增加可能起着损伤机体的作用；而ＣＧＲＰ升高可能是机体的自我保护机制。     

HSV-tk基因特异性杀伤大肠癌细胞的实验研究

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－tk)ad基因在大肠癌组织细胞中特异地表达, 以达到靶向基因治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动tk基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡtkＮa,然后以重组逆转录病毒上清染法将重组组织特异性载体及非组织特异性载体分别转导入高分泌ＣＥＡ的大肠癌ＬoＶo细胞中,以Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后给予前药更昔洛韦（ＧＣＶ）进行敏感试验。结果：转导     

胎膜早破时粒细胞集落刺激因子测定的临床意义

目的：了解胎膜早破时测定粒细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＧＣＳＦ）的临床意义。方法：测定６４例胎膜早破产妇在分娩时母血清及脐血清的ＧＣＳＦ和Ｃ反应蛋白（ｃｒｅａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＰ）水平，同时以６４例正常产妇做对照。结果：观察组母及脐血清ＧＣＳＦ阳性分别为１０和１２例，较对照组４和５例增高，Ｐ＜０．０５；血清ＧＣＳＦ和ＣＲＰ都异常或脐血清任何一项测定异常时，７５％～１００％新生儿发病；观察组与对照组分别有２６与１６例新生儿发病，Ｐ＜０．０５。结论：胎膜早破时测定ＧＣＳＦ对预测新生儿的发病有一定的临床价值     

人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的：构建携带人神经生长因子（ｈ Ｎ Ｇ Ｆ） 基因的真核细胞表达载体,为应用 Ｎ Ｇ Ｆ 进行老年性痴呆（ Ａ Ｄ） 等疾病基因治疗打基础。方法：应用基因重组技术将ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 中ｈ Ｎ Ｇ Ｆ基因的插入方向,用 Ｐ Ｃ Ｒ、斑点杂交和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交对重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 作进一步鉴定。结果：ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,而构建成重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ。结论：真核细胞表达载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 的成功构建,为进一步开展 Ｎ Ｇ Ｆ基因治疗 Ａ Ｄ 等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

Rb基因对血管平滑肌细胞生长抑制作用的研究

目的探讨腺病毒载体介导的Ｒｂ基因对血管平滑肌细胞的作用，及其应用于动脉粥样硬化及动脉再狭窄基因治疗的可能性。方法构建Ｒｂ基因的重组腺病毒载体，体外转染兔血管平滑肌细胞。应用生化染色、免疫组化及聚合酶链反应检测基因的转染效率、基因表达情况。应用细胞计数、同位素掺入、流式细胞仪检测手段，观察Ｒｂ基因对平滑肌细胞生长的作用。结果腺病毒载体能快速有效地将外源性基因导入平滑肌细胞并表达。Ｒｂ基因导入可抑制平滑肌细胞生长，减少细胞ＤＮＡ合成，减少合成后期和分裂期细胞量，增加静止期和合成前期细胞。结论腺病毒载体介导Ｒｂ基因导入有可能作为动脉粥样硬化及动脉再狭窄的基因治疗手段。     

hIL-10基因转导抑制大鼠心肌细胞诱生炎症细胞因子

目的：观察人白细胞介素１０ （ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ,ｈ Ｉ Ｌ１０） 基因转导对脂多糖（ Ｌ Ｐ Ｓ） 诱导大鼠心肌细胞（ Ｃ Ｍ Ｃ） 的炎症细胞因子的产生及其基因表达的影响。方法：通过重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ（ Ｉ Ｌ１０） Ｓ Ｎ 将人 Ｉ Ｌ１０ 基因导入大鼠 Ｃ Ｍ Ｃ,应用 Ｐ Ｃ Ｒ, Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ：①检测 Ｉ Ｌ１０ 基因的整合和表达;②观察 Ｉ Ｌ１０ 基因转导对 Ｌ Ｐ Ｓ诱导的 Ｃ Ｍ Ｃ 肿瘤坏死因子α（ Ｔ Ｎ Ｆα） 的ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达及白细胞介素１β（ Ｉ Ｌ１β） 和 Ｔ Ｎ Ｆα的蛋白质的产生的影响。结果：外源性 Ｉ Ｌ１０ 基因已整合到靶细胞染色体 Ｄ Ｎ Ａ 并有效地表达,并能抑制 Ｌ Ｐ Ｓ诱生 Ｃ Ｍ Ｃ 产生 Ｉ Ｌ１β, Ｔ Ｎ Ｆα。结论：逆转录病毒载体介导的人 Ｉ Ｌ１０ 基因转导能抑制 Ｃ Ｍ Ｃ 炎症效应中细胞因子的产生及其基因表达。     

vIL-10逆转录病毒载体构建及在鼠成纤维细胞中的表达

目的：探讨ｖＩＬ１０的免疫抑制作用，为应用ｖＩＬ１０进行免疫基因治疗打基础。方法：用基因重组技术将ｖＩＬ１０ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，并用脂质体法导入包装细胞ＰＡ３１７，取其上清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３。结果：经筛选获得抗Ｇ４１８的ＮＩＨ３Ｔ３阳性克隆，用ＲＴＰＣＲ，ＥＬＩＳＡ方法检测到ｖＩＬ１０的表达，用３ＨＴｄＲ法检测到ｖＩＬ１０对ＭＬＲ的抑制作用。结论：构建ｖＩＬ１０逆转录病毒表达载体并转染小鼠成纤维细胞，初步证实ｖＩＬ１０具有免疫抑制作用。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

HSV-tk基因对实验性血管成形术后再狭窄的抑制作用

为探讨转染单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ ｔｋ）基因联合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）治疗方案用于治疗冠状动脉成形术后再狭窄的可行性,构建了携带ＨＳＶ ｔｋ基因的复制缺陷型逆转录病毒,利用该病毒将ＨＳＶ ｔｋ基因转染至体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）和大鼠腹主动脉再狭窄模型的损伤动脉中,并均给予ＧＣＶ,分别观察上述处理对ＶＳＭＣ的增殖和新生内膜的形成是否有抑制作用。结果：该方案使培养的ＶＳＭＣ增殖受抑制,抑制程度对ＧＣＶ有剂量依赖关系;既往在恶性肿瘤中发现的旁观者效应,在培养的ＶＳＭＣ中也存在。同时,该方案使大鼠腹主动脉再狭窄模型的新生内膜面积减少。但单纯转染ＨＳＶ ｔｋ基因或单纯应用ＧＣＶ无论在体外还是在体内均无上述抑制作用。提示本基因治疗方案对人类冠脉成形术后再狭窄有治疗价值。     

野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型ｐ５３基因逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体介导，将野生型ｐ５３基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１ｄ后观察其对新生内膜形成的影响，并检测ｐ５３蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型ｐ５３基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中表达；用逆转录病毒载体转导野生型ｐ５３基因至大鼠球囊损伤的颈动脉，免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型ｐ５３蛋白，且与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４４％。结论人野生型ｐ５３基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用     

野生型Rb基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的：探讨人野生型Rb基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法：通过逆转录病毒载体介导，将野生型Rb基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，21天后观察其对新生内膜形成的影响，并检测Rb蛋白表达水平。结果：成功地构建和包装了人野生型Rb基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中成功表达；免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型Rb蛋白，与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了49％。结论：人野生型Rb基因治疗时血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达及生物活性分析

采用RT PCR方法 ,从人扁桃体组织中扩增得到人胰岛素样生长因子 1 (IGF 1 )cDNA ,利用基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3 .1 ( +)真核表达载体上 ,成功构建了 pcDNA/I重组表达载体。应用脂质体介导的基因转移技术将重组质粒体外转染至人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。MTT法检测结果表明 :重组质粒转染能明显促进内皮细胞的分裂增生。将重组质粒通过脂质体介导 ,体外转染至人肾细胞 2 93细胞系进行表达 ,经G41 8筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆 ,表达产物经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血管生成活性。此结果为研究IGF 1对血管内皮细胞作用的分子机制 ,以及利用IGF 1基因治疗肢体及冠状动脉缺血性疾病等的研究奠定了实验基础。     

VEGF逆转录病毒载体构建及在小鼠骨髓中的表达(英文)

Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｐｌａｙｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｂｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ,ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇａｎｄｈｅａｌｉｎｇ Ａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆｂｏｎｅｎｅｃｒｏｓｉｓ,ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｏｎｅｄｉｓｅａｓｅｈａｓａｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｃｕｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｉｎａｖａｓｃｕｌａｒｂｏｎｅｄｉｓｅａｓｅ ,ｎｏｖｅｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓａｒｅｄｅｓｐｅｒａｔｅｌｙｎ…     

慢病毒载体介导CG RP基因体外转染及对M SC生物学特性的影响

目的：探讨慢病毒载体介导降钙素基因相关肽（CGRP）基因体外转染间充质干细胞（MSC）及其对MSC生物学特性的影响。方法大鼠MSC进行分离、培养及鉴定。CGRP重组慢病毒转染MSC后,采用荧光显微镜和流式细胞技术测定其转染率。实时定量PCR、免疫荧光细胞化学及ELISA法检测MSC中CGRP的表达。慢病毒转染后通过MTT、β‐半乳糖苷酶染色和诱导分化评价MSC的增殖、衰老及分化能力。结果慢病毒载体介导CGRP基因转染 MSC后48 h可稳定表达,MOI＝30时,转染率达80％以上。与MSC组和空载病毒转染（MSC‐EGFP组）比较,CGRP修饰的MSC（MSC‐CGRP组）中CGRP的mR‐NA和蛋白表达水平增高（均 P＜0．01）。MTT、β‐半乳糖苷酶染色和诱导分化结果显示,病毒转染后对MSC增殖、衰老及向内皮分化基本没有影响。结论 MSC是一种理想的基因载体细胞,可作为CGRP基因转染的靶细胞用于基因治疗,为后续体内、体外实验奠定基础。     

Expression of human VEGF121 cDNA in mouse bone marrow stromal cells

目的构建人VEGF121逆转录病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性.方法采用分子克隆技术从pCDⅠ/VEGF121质粒获得hVEGF121cDNA, 并克隆到pLXSN逆转录病毒质粒.经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒, 并进行滴度测定.培养小鼠骨髓基质细胞,用重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞.经筛选后,用PCR及RT-PCR方法测hVEGF121cDNA在基质细胞中的整合及转录;用免疫印迹及免疫组化检测VEGF121蛋白的表达;用MTT检测转基因细胞培养上清中VEGF的促人内皮细胞增殖活性.结果经酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒正确,包装的病毒滴度为6×105.PCR证实基因组DNA有hVEGF121cDNA的整合;RT-PCR证实有hVEGF121mRNA的转录;Western blot及免疫组化检测有VEGF121蛋白的表达;MTT试验显示转基因细胞培养上清中VEGF121能促进人内皮细胞增殖.结论我们成功地构建了pLXSN/VEGF121重组逆转录病毒载体,该载体不仅能够有效地表达VEGF121蛋白,且表达的蛋白具有促进人内皮细胞增殖的生物学活性,这些均为进一步应用该载体研究VEGF基因治疗骨科缺血性疾患打下了基础.     

Anti-tumor effect of human endostatin mediated by retroviral gene transfer in nude mice

目的　探讨逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因 (endostatin)对人肝癌细胞的生长抑制作用。方法　利用逆转录病毒载体pLncx构建含有人endostatin基因及信号肽的重组逆转录病毒质粒 ,并将其导入PA317细胞制备重组病毒。用重组病毒感染人肝癌细胞SMMC772 1获得稳定转人endostatin基因细胞株 (SMMC endo)。同样用空白病毒质粒制备对照细胞株SMMC pLncx。免疫组化及Westernblot检测人endostatin基因在转染细胞株中的表达和分泌。应用血管内皮细胞生长抑制试验验证转染细胞株表达的人endostatin的生物学活性。同时对转染细胞株在体内外的生长情况进行观察。结果　免疫组化及Westernblot印迹分析证实转染人endostatin基因的肝癌细胞能表达并分泌人endostatin。与转染空白对照组 (SMMC pLncx)相比 ,表达人endostatin的SMMC772 1浓缩上清可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞生长 ,抑制率达 4 8% ,明显高于对照组 10 2 % (P <0 0 1)。体外生长实验显示 ,SMMC endo细胞与对照细胞SMMC pLncx体外生长速率无明显差别。而在转染细胞接种裸鼠 2 2d后 ,转染人endostatin基因的肿瘤细胞生长明显受到抑制 ,仅在部分裸鼠 (3/ 5只 )体内长出肿瘤 ,并且产生的腹侧肿瘤体积较对照组肿瘤缩小 94 5 % (P <0 0 0 1)。结论　逆转     

转染血小板第四因子氨基末端改构体cDNA 抑制裸鼠实体肿瘤生长的研究

目的研究血小板第四因子(PF4)氨基末端改构体cDNA (p17-70)在实体肿瘤中抗血管新生基因治疗中的作用.方法构建PF4及p17-70重组逆转录病毒载体(pLXSN-PF4和pLXSNp17-70),通过包装细胞系(PA317-PF4和PA317p17-70)产生的病毒上清转染人头颈部癌(KB)细胞系,并建立KB细胞裸鼠移植瘤动物模型.体外实验观察MTT法检测转染的KB细胞增殖指数及重组逆转录病毒上清和重组分泌型PF4s对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响;体内实验24只裸鼠,分KB-PF4、KBP17-70、野生型KB组和空载体4组,观察裸鼠移植瘤生长状态、死亡时间、及病理切片计数血管密度,并重复实验一次.结果 KB-PF4s和野生型KB细胞增殖指数无显著差异(P>0.05),PA317-PF4s病毒上清和KB-PF4s细胞培养液可特异性抑制HUVEC增殖(P<0.05).KB-PF4和KBp17-70细胞在同源裸鼠体内生长速度减慢(P<0.01,P<0.001).与野生型KB组和空载体组相比较(1.69 g±0.35 g,1.94 g±0.25 g),KB-PF4组和KBp17-70组的瘤体平均重量明显减轻(0.96 g±0.21 g,0.80 g±0.34 g)(P<0.05).实验荷瘤鼠生存时间延长(P<0.05),移植瘤中新生血管密度明显减少(P<0.001).与KB-PF4相比较,KBp17-70细胞在同源裸鼠体内生长速度减慢更加明显,生存时间延长更为显著(P<0.05),移植瘤中新生血管密度减少更为明显.结论逆转录病毒载体介导的血小板第四因子相关多肽基因治疗,具有靶向性抗肿瘤组织中血管新生作用, 能明显地抑制肿瘤生长.     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。