靶向RANKL基因的siRNA对成骨细胞促破骨细胞生成作用的影响

目的利用RNA干扰(RNAi)技术抑制大鼠成骨细胞核激活因子受体配体(Ligand of receptor activator of NF-κB,RANKL)的表达,观察成骨细胞RANKL/OPG比值的变化,探讨成骨细胞与破骨细胞生成的相关性。方法合成4条RANKL序列特异性小干扰RNA(siRNA),用Liopfectamin2000转染成骨细胞,采用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)检测RANKL的表达,筛选出最有效的干扰序列,并用Western blot技术检测成骨细胞的RANKL、OPG的表达,观察RANKL/OPG比例的变化,采用成骨细胞破骨细胞共培养技术探讨转染后的成骨细胞对破骨细胞生成的影响。结果合成的4对siRNA中有一对可使大鼠成骨细胞的RANKL mRNA水平下降89%,蛋白表达下降76%;同时OPG的蛋白表达无明显变化,RANKL/OPG比例明显下调,破骨细胞的生成明显受到抑制。结论RNAi沉默RANKL基因表达可显著下调成骨细胞RANKL/OPG的比值,抑制破骨细胞的生成。     

低氧/低氧诱导因子-1α通路对成骨细胞与破骨细胞耦联的调控作用

目的 探讨低氧/低氧诱导因子(HIF) -1α通路对成骨细胞与破骨细胞耦联的调控作用.方法 取出生2～3d条件性基因敲除小鼠颅盖骨的成骨细胞与4～8周龄C57BL/6小鼠股骨破骨细胞的前体细胞,建立基因敲除小鼠成骨细胞与破骨细胞前体细胞共培养体系(野生型、HIF-1α-/-、Vhl-/-、HIF - 1α-/-/Vhl -/-共培养).采用RT-PCR技术检测成骨细胞中核因子κB受体活化因子配体(RANKL) mRNA和骨保护素(OPG) mRNA的表达以及破骨细胞中标志酶基因TRAP mRNA的表达,甲苯胺蓝染色观察破骨细胞溶骨形成的骨陷窝.结果 RT-PCR检测结果显示:与野生型共培养比较,HIF-1α-/-共培养的成骨细胞中RANKL mRNA表达上调、OPG mRNA表达下调(均P＜0.05),破骨细胞TRAP mRNA表达上调;Vhl-/-共培养和HIF-1α-/-/Vhl-/-共培养的成骨细胞中RANKL mRNA表达下调、OPG mRNA表达显著上调(均P＜0.05),破骨细胞TRAP mRNA表达下调;随着共培养时间的延长,成骨细胞中RANKL mRNA和OPG mRNA表达均逐渐减少,而破骨细胞TRAP mRNA表达均逐渐增加.甲苯胺蓝染色倒置显微镜观察显示:共培养第9天,破骨细胞骨吸收陷窝出现;随着共培养时间的延长,骨吸收陷窝面积和深度逐渐增加;与野生型共培养比较,HIF-1α-/-共培养的破骨细胞骨吸收陷窝较大且较深,Vhl-/-和HIF-1α-/-/Vhl-/-共培养的破骨细胞骨吸收陷窝较小且较浅.结论 低氧/HIF-1α通路激活后,成骨细胞抑制破骨细胞的分化功能;低氧/HIF-1α通路阻断后,成骨细胞促进破骨细胞的分化功能.     

1,25(OH)2D3对体外培养大鼠成骨细胞RANKL/OPG mRNA表达的影响

目的：观察1,25（OH）2D3对体外培养的大鼠成骨细胞RANKL／OPG mRNA表达的影响,探讨其促进骨吸收的作用机制。方法：体外分离培养大鼠成骨细胞,分别观察不同浓度1,25（OH）2D3及用1,25（OH）2D,处理不同时间对RANKL／OPG mRNA表达的影响,RANKL／OPG mRNA表达采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定。结果：1,25（OH）2D3呈时间和剂量依赖性地刺激大鼠成骨细胞RANKL mRNA的表达,而抑制OPG mRNA的表达,使RANKL／OPG值增高。结论：1,25（OH）2D3通过调节成骨细胞RANKL／OPG的基因表达,从而发挥促进破骨细胞介导的骨吸收作用。     

不同浓度降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞OPG mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠成骨细胞OPG mRNA的表达影响.方法 采用新生大鼠颅盖骨组织块培养成骨细胞,加入不同浓度CGRP干预体外培养成骨细胞,观察成骨细胞增殖和ALP活性,检测OPG mRNA及RANKL mRNA的表达水平.结果 CGRP在浓度为1×10-8mol/L时对成骨细胞增殖的促进作用最强,在1×10-9mol/L时对成骨细胞ALP活性的促进作用最强;CGRP不仅能明显增强OPG mRNA的表达水平(P＜0.05),还能明显抑制RANKL mRNA的表达水平(P＜0.05),以10-8和l0-7浓度时表达最为明显,均呈剂量依赖性;且CGRP可明显上调OPG/RANKL的比值(P＜0.05).结论 CGRP对成骨细胞增殖和活性均有促进作用,可能通过上调成骨细胞OPG/RANKL,最终发挥抑制骨吸收的作用.     

左归丸含药血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

目的通过观察左归丸含药血清对成骨细胞骨保护素(OPG)、细胞核因子-κB受体活化因子配基(RANKL)mRNA表达的影响,探讨其治疗骨质疏松症的作用机制。方法体外分离、培养成骨细胞,实验分为3组:正常血清组、卵巢切除血清组、卵巢切除含药血清组。采用原位杂交法,检测成骨细胞OPG、RANKL mRNA的表达。结果卵巢切除血清组与正常血清组相比,成骨细胞OPG mRNA的表达显著下调,而RANKL mRNA表达明显上调;卵巢切除含药血清组与卵巢切除血清组相比,成骨细胞OPG mRNA的表达明显上调,RANKL mRNA的表达明显下调;而与正常血清组相比,无显著性差异。结论在去势状态下,左归丸含药血清一方面直接抑制RANKL的分泌,使破骨细胞活性降低;另一方面促进成骨细胞分泌OPG,使之与RANKL的结合增多,进而使破骨细胞活性降低,从而达到治疗骨质疏松的目的。     

阿仑磷酸钠对大鼠成骨细胞代谢调控的研究

目的 探讨阿仑磷酸钠对大鼠成骨细胞代谢调控的影响.方法 取新生SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞.用MTT、ALP检测和Western Blot方法 观察阿仑磷酸钠对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和OPG、RANKL蛋白表达的影响.结果 阿仑磷酸钠对成骨细胞增殖无明显影响,但能提高成骨细胞碱性磷酸酶活性,增强OPG蛋白的表达,降低RANKL蛋白的表达(P<0.05或P<0.01).结论 阿仑磷酸钠能促进成骨细胞的分化,并通过调节OPG/RANKL蛋白比值影响骨代谢.     

骨破坏因子RANK RANKL OPG在口腔领域研究进展

OPG/RANKL/RANK系统信号通路对调节破骨细胞分化与骨吸收过程中具有至关重要的作用。成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后,促进破骨细胞的分化与激活,并抑制破骨细胞的凋亡;另一方面成骨细胞及骨髓基质细胞则分泌表达OPG与RANKL竞争性结合,阻止RANKL与RANK的结合。作为破骨细胞形成、分化和骨吸收调节的关键调节物OPG/RANKL/RANK系统信号通路在口腔领域中乳牙的萌出及替换、正畸牙的移动、牙周炎等生理性及病理性过程中的改建发挥功能。     

川续断皂苷Ⅵ通过JNK信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

【目的】探讨川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞方向分化的机制。【方法】全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs。实验分为诱导组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+5μmol/L SP抑制组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+10μmol/L SP抑制组,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+20μmol/L SP抑制组等5组。采用茜素红染色和骨钙素定量法检测细胞成骨分化程度;采用碱性磷酸酶(ALP)染色测定ALP活性;采用生物信息学方法预测c-Jun氨基末端激酶(JNK)相关因子。【结果】与诱导组比较,1μmol/L续断皂苷Ⅵ组茜素红染色明显增加,ALP活性增强,骨钙素表达量增加(P0.05)。与1μmol/L川续断皂苷Ⅵ组比较,1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+5μmol/L SP抑制组、1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+10μmol/L SP抑制组、1μmol/L川续断皂苷Ⅵ+20μmol/L SP抑制组茜素红染色程度降低,ALP活性减弱,骨钙素含量显著减少(P0.05)。生物信息学表明c-Jun和转录激活因子4(ATF4)、骨形态发生蛋白2(BMP2)之间存在直接的相互联系。【结论】川续断皂苷Ⅵ诱导BMSCs成骨分化的机制可能与JNK信号通路的激活有关。     

护骨胶囊对成骨细胞增殖、分化影响

目的：探讨护骨胶囊对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。方法：采用多次酶消化法分离出大鼠颅盖骨的成骨细胞,采用MTT法和碱性磷酸酶法分别检测护骨胶囊对成骨细胞增殖和分化的作用;采用SYBRgreenI嵌合的RT-PCR方法检测Runx2mRNA表达水平。结果：护骨胶囊在浓度0.025~2.5μg/mL对成骨细胞有促增殖的作用,护骨胶囊在浓度0.025~25μg/mL对碱性磷酸酶的活性均有提高的作用,护骨胶囊在浓度25μg/mL下,对Runx2mRNA水平有上调的作用。结论：护骨胶囊对成骨细胞有促增殖、促分化的作用,可能与上调Runx2mRNA水平有关。     

ERK信号通路对钛合金诱导成骨细胞RANKL、OPG表达的作用

目的 探讨钛合金颗粒对体外培养的小鼠成骨细胞核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及骨保护素(OPG)基因表达和蛋白分泌的影响,以及细胞外信号调控激酶1/2(ERK1/2)信号通路在其中的作用.方法 体外培养成骨细胞.实验分3组:对照组(A组);钛合金组(B组):给予浓度为0.1 g/L钛合金颗粒干预;抑制剂组(C组):给予钛合金颗粒+ERK信号通路抑制剂PD98059,每组6个样本.采用RT-PCR和ELISA法分别检测成骨细胞RANKL、OPG基因和蛋白表达.结果 3组各个时间点均可见RANKL、OPG的表达;但B组RANKL、OPG mRNA的表达和蛋白分泌量以及RANKL/OPG比值显著高于A组(P<0.01);而C组RANKL、OPG mRNA的表达和蛋白分泌水平以及RANKL/OPG比值的增幅显著小于B组(P<0.01).结论 钛合金颗粒可刺激成骨细胞RANKL mRNA、OPG mRNA的表达并促进RANKL、OPG蛋白的分泌,增加RANKL/OPG比值;ERK信号通路抑制剂PD98059可一定程度抑制RANKL和OPG的表达,降低RANKL/OPG比值,对减少假体周围骨溶解的发生可能起重要作用.     

骨康含药血清对细胞共育体系中OPG、RANKL的影响

目的:研究骨康含药血清对细胞共育体系中OPG、RANKL的影响。方法:以成骨-破骨细胞共培养液上清中OPG、RANKL及其比值为指标进行实验观察。结果:加入血清培养后,自第3天起骨康组OPG含量明显高于同时期空白组(P0.01),而空白组培养过程中无明显变化。骨康组RANKL含量第7天明显下降(P0.05),而空白组无明显变化(P0.05)。自第3天起骨康组OPG/RANKL比值显著高于空白组(P0.05,P0.01)。在培养第5、7天骨康组OPG/RANKL比值较初始比值明显增大(P0.05),而空白组在培养过程中无明显变化。结论:骨康含药血清对成骨细胞和破骨细胞均有影响,可改变细胞生存环境中OPG/RANKL的比例,间接影响破骨细胞的功能活性。     

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10（CPN10）对成骨细胞（OB）-外周血单个核细胞（PBMs）共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10（10μg/ml）处理组。主要观察指标：①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG 相对浓度分别为33.4798±177;2.0929、47.974±177;5.1628、47.0861±177;2.2033、7.4642±177;0.6791（P〈0.05）,对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞（OB-PBMs）共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。     

富血小板纤维蛋白对体外培养成骨细胞的影响

目的研究富Choukroun’s血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)对体外培养鼠成骨细胞的影响。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定ALP活性,蛋白免疫印迹方法(Western-blot)测定各组鼠成骨细胞内骨保护蛋白(OPG)及核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)蛋白的表达情况。结果 PRF可促进成骨细胞的增殖、ALP的分泌,促进OPG的表达,但对RANKL基因表达不明显。结论 PRF可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化及骨保护素的表达。PRF可能通过影响骨保护素及其配体而调节成骨细胞、破骨细胞的平衡,使骨重建。     

低氧诱导因子-1α通路在成骨细胞及破骨细胞耦联中的调控效果探讨

目的探讨成骨细胞及破骨细胞耦联中低氧诱导因子-1α通路调控效果。方法选取出生2~3d条件性基因敲除小鼠及SFP级4~8周龄C578B/L6小鼠,行破骨与成骨细胞共培养体系建立及培养。结果采用RT-PCR检查鉴定结果:HIF-1α基因条带长度经观察为112bp,依据净吸光值,对HIF-1α1/1成骨细胞对应的基因敲除率推算,结果90%。经观察Vhl基因条带长度为265bp,基因敲除率同上。相较野生型共培养,HIF-1α1/1共培养的成骨细胞中基因RANKL mRNA表达呈上调显示,HIF-1α1/1/Vhl1-1和Vh-1-共培养的成骨细胞中OPG mRNA表达上调,RANKL mRNA表达下调,有统计差异(P0.05)。结论激活低氧/HIF-1α通路后,成骨细胞对破骨细胞的分化功能抑制,阻断低氧/HIF-1α通路后,成骨细胞对破骨细胞的分化功能有促进作用。     

杜仲对MC3T3-E1成骨细胞及OPG/RANKL比值的影响

目的:探讨杜仲对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)及骨保护素(OPG)与细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)比值的影响,为杜仲防治骨质疏松症提供基础。方法:MC3T3-E1成骨细胞按5×103个/孔密度接种于96孔板,加药组的浓度分别为10-1、10-2、10-3mg/mL,对照组为未加药。加药72 h后MTT法检测细胞增殖情况、碱性磷酸酶(ALP)的分泌,ELISA方法检测OPG和RANKL的表达水平,并计算OPG/RANKL的比值。结果:与对照组相比,杜仲10-1mg/mL组在细胞增殖及ALP的分泌均有明显促进作用(P<0.01,P<0.05);可明显抑制RANKL的表达(P<0.05),且表现出浓度依赖性;对OPG有促进表达的作用,但与空白对照组比较无统计学意义(P>0.05)。经计算杜仲可上调OPG/RANKL的比值(P<0.05)。结论:杜仲可通过促进MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化成熟,并上调OPG/RANKL的比值,间接抑制破骨细胞的分化和成熟,从而抑制骨吸收,可达到预防与治疗骨质疏松症的目的。     

不对称正畸力对成年大鼠双侧髁状突软骨下骨RANKL/OPG的影响

目的:通过建立下颌骨单侧前上牵引的大鼠动物模型模拟正畸颌间不对称牵引对成年颞下颌关节的影响,研究牵引力对双侧髁状突软骨下骨RANK配体(RANKL)和骨保护素(OPG)表达和比例关系的影响,并观察去除牵引力后的组织反应.方法:利用外科手术方法在80只SD大鼠左侧下颌角与同侧颧弓前区置入镍钛拉簧,使左侧下颌骨受到前上方向的40 g持续牵引力,4 wk后拆除弹簧.实验动物分别在手术后和拆除弹簧的3,7,14,28 d处死,用免疫组化法检测双侧髁状突软骨下骨中RANKL/OPG蛋白表达的变化.结果:髁状突软骨下骨中RANKL和0PG共同表达在成骨细胞、破骨细胞和早期骨细胞中,对照组大鼠RANKL/OPG蛋白表达量(积分光密度)的比值为0.246±0.013.在外力加载或撤除的1 wk内,RANKL/OPG比值显著增加(P<0.01).实验大鼠加力侧和非加力侧RANKL/OPG比值无显著相关性(r=0.45,P0.01).结论:在40 g颌间不对称力作用下,双侧髁状突软骨下骨的改建活动均有增强.加力侧RANKL/OPG比值变化幅度大于非加力侧,而且对牵引力的反应更为迅速,撤除牵引力会导致口颌系统新的不平衡和骨吸收活跃.     

吡格列酮对单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化过程中核因子κB受体活化因子的影响

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在破骨细胞分化过程中的作用及机制.方法 将小鼠单核细胞RAW264.7分为正常对照组、核因子κB受体活化子配体(RANKL)诱导组(使用30μg/L的RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化)和吡格列酮刺激组(在使用30 μg/L的RANKL诱导破骨细胞分化的同时给予10μmol/L的吡格列酮刺激,持续至分化全程),待破骨细胞分化成熟以后进行破骨细胞染色、计数,并利用实时定量PCR检测单核细胞向破骨细胞分化过程中核因子κB受体活化子(RANK)的mRNA表达量.结果 吡格列酮抑制单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化,吡格列酮组的破骨细胞数目(176±58)个/cm2明显低于RANKL诱导组(322±74)个/cm2,差异有统计学意义(P＜0.01);吡格列酮抑制单核细胞RAW264.7分化过程中RANK的mRNA表达量,对照组(1.13±0.26);吡格列酮组(2.16±0.74)明显低于RANKL诱导组(4.94±0.39),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 吡格列酮抑制了单核细胞RAW264.7向破骨细胞的分化,这可能与PPARγ激动剂下调了RANK的表达,进一步抑制破骨细胞分化有关.     

重组人骨形态发生蛋白2缓释体对铬磨损颗粒诱导的溶骨效应的影响

目的建立大鼠植骨气囊模型,观察在不同浓度重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)缓释体干预下气囊内组织的破骨细胞分化因子(RANKL)、骨破坏素(OPG)表达情况。方法在大鼠背部注入空气形成气囊,取同源大鼠的颅骨植入气囊内。将已制成的植骨气囊模型大鼠分成5组:空白组、铬颗粒组、50μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组、100μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组和200μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组。各组分别用药处理,2周后取出囊腔内组织进行RANKL、OPG的Wester-blot、Rt-PCR检测,并对囊腔内骨片行TRAP染色,用计算机图像分析技术测定骨片破骨细胞染色面积,进行药效评价。结果 RANKL、OPG在各组囊腔组织中均有表达。骨片破骨细胞染色面积、RANKL、OPG的Wester-blot和RT-PCR结果及RANKL/OPG值,在铬颗粒组中明显高于其他4组(P<0.05);在3个rhBMP-2缓释体干预组内,随着rhBMP-2缓释体浓度增高呈递减趋势,组间差异均有统计学意义(P<0.05);在空白组和200μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组间未见明显差异(P>0.05)。结论大鼠植骨气囊模型成功的模拟了人工关节无菌性松动的生物学和组织学特征。铬颗粒可以引起RANKL/OPG值升高,促进溶骨;rhBMP-2缓释体通过降低RANKL/OPG值,从而促进成骨、抑制骨吸收效益。     

益肾蠲痹法含药血清对大鼠成骨和破骨细胞OPG/RANKL/RANK信号通路的影响

目的 探讨益肾蠲痹法含药血清对骨代谢信号通路的影响。 方法 正常SD大鼠随机分为对照组和益肾蠲痹组,分别经生理盐水和益肾蠲痹汤灌胃给药,获取含药血清;分离大鼠成骨细胞和破骨细胞,利用碱性磷酸酶和Van kossa染色鉴定成骨细胞,TRAP和甲苯胺蓝染色鉴定破骨细胞;将成骨和破骨细胞各分为4组:对照组、益肾蠲痹法含药血清低、中和高浓度组;通过免疫印迹检测成骨细胞骨保护蛋白(OPG)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和破骨细胞核因子κB受体活化因子(RANK)的表达。 结果 低、中、高浓度含药血清诱导成骨细胞OPG的表达分别为对照组的97%(P=0.710)、122%(P=0.005)和155%(P<0.001),RANKL表达分别为对照组的81%(P<0.001)、63%(P<0.001)和53%(P<0.001),表明OPG和RANKL表达与含药血清浓度分别呈正、负相关;含药血清使破骨细胞RANK表达分别调节对照组的75%(P<0.001)、50%(P<0.001)和46%(P<0.001),表明RANK表达与含药血清剂量呈负相关。 结论 益肾蠲痹法含药血清通过调节OPG/RANKL/RANK信号轴可能在抗骨丢失过程中发挥作用。      

续断苷对人成骨细胞增殖和分化作用研究

目的:观察续断苷对体外培养人成骨细胞的增殖和分化的影响。方法:取人髂骨松质骨分离培养成骨细胞,传代后用含续断苷的培养液培养,用MTT方测定成骨细胞的增殖,并测定碱性磷酸酶(ALP)的活性。结果:浓度为1,10,100μg/ml的续断苷培养液促进成骨细胞的增殖;浓度为10,100μg/ml的续断苷培养液促进成骨细胞碱性磷酸酶分泌。结论:续断苷在一定浓度范围内促进人成骨细胞的分化与增殖。