结核分支杆菌重组38 000蛋白的免疫原性特征

目的了解结核分支杆菌重组３８０００蛋白（ｒＭＴ３８）诱发家兔产生抗体的能力及作为血清学诊断试剂的价值。方法将家兔分为６组：ＰＰＤ＋生理盐水（Ａ组）,ｒＭＴ３８＋生理盐水（Ｂ组）ｒＭＴ３８＋佐剂（Ｃ组）,１／２ｒＭＴ３８＋１ｒＭＴ１６＋生理盐水（Ｄ组）,１／２ｒＭＴ３８＋１／２ｒＭＴ１６＋佐剂（Ｅ组）,ｒＭＴ１６＋佐剂（Ｆ组））。用ＥＬＩＳＡ法测Ｃ、Ｅ两组血清是否与分支杆菌ＰＰＤ有效叉反应。双向扩散     

结核分支杆菌16000抗原基因在大肠杆菌中的高效表达及 …

目的 获得高效表达结核分支杆菌１６０００抗原的大肠杆菌工程菌,将培养物纯化后得到重组１６０００蛋白抗原纯品,并检测其免疫学特性。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ）分析重组蛋白抗原的相对分子质量大小及表达形式。ＤＥＡＥ及ＰＥＩ凝胶纯化重组蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹及酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）分析重组蛋白的免疫原性。结果 构     

结核分支杆菌热休克蛋白65kD在大肠杆菌中表达

目的 构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白65KD的工程菌。方法 设计引物并PCR扩增，目的基因克隆并转化，重组子经酶切和自动测序鉴定，阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组65kd蛋白。结果 65KD蛋白编码基因约1.6kd，重组子单酶切和双酶切证明目的的基因插入载体，3个测序反应覆盖99.1%目的基因；大肠杆菌表达重组65kd蛋白。结论 大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分枝杆菌抗原的途径。     

几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的：了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6（E）、MPT64（M）、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏（DTH）反应的能力。方法：常规皮肤实验法：灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠，皮肤试验以生理盐水为阴性对照，5U PPD标准品为阳性对照，0．8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA 0.4μgM、0.4μgA 0.4μgE、0.4μgE 0.4μgM分别于背部皮内注射，注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径（mm），取二者的平均值。皮肤试验轮圈法：生理盐水、5U PPD及0．8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA 0.4μgM、0.4μgA 0.4μgE、0.4μgE 0.4μgM，以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧，每批6只，共3批。注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径（mm），取二者的平均值。结果：常规皮肤试验0．8μgM、A、M＋E及E＋A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异（P＞0．05），而0．8μgE抗原及M＋A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异（P＜0．05）。时间效应：重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径24h平均直径显著高于48h平均直径（P＜0．05），24h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后，结果与常规皮肤试验结果一致。结论：从试验结果看，重组ESAT6抗原及MTP64与Ag85A混合物诱发豚鼠DTH反应强于PPD。     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌DNA

OBJECTIVE: To improve the specificity and sensitivity of polymerase chain reaction (PCR) technique for detecting and identification of DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis. METHOD: Three pairs of oligonucleotide primer were used in triplex-PCR. A 383 bp DNA fragment encoding part of the 65,000 mycobacterial surface antigen, a 123 bp fragment corresponding to a specific M. tuberculosis complex sequence which was the insertion sequence 6110 (IS 6110) and a 268 bp fragment for human beta-globin were amplified by triplex-PCR respectively. RESULT: The sensitivity of the triplex-PCR-electrophoresis for the DNA of mycobacterium was 0.6 pg. The specific bands of 383 bp and 123 bp among the amplified DNA from M. hominis, M. bovis, BCG and M. simiae were present in the agarose gel. By contrast, only a band of 383 bp was found among the M. nontuberculosis which contained M. avium, M. chelonae, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. kansasii, M. intracellulare and M. smegmatis. Compared with the standard strains, there was an additional 268 bp band in simulated clinical samples infected by Mycobacterium. The above 3 specific bands were found neither in other 15 bacterial species tested nor in Mycoplasma pneumoniae. 182 clinical samples were examined by culture, smear and triplex-PCR. 72 nontuberculous clinical samples were all negative. In 110 tuberculosis clinical samples, the positive rates were 2.7%, 13.6% and 32.7%, respectively. CONCLUSION: The triplex-PCR possesses a high specificity and sensitivity. This method could detect and identify the DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis except M. simiae. It is a valuable tool for early diagnosis and differentiation for infection of M. tuberculosis and M. nontuberculosis.     

不同结核分支杆菌抗原对结核病的诊断价值

目的　研究不同结核分支杆菌单体蛋白抗原在结核病体液免疫诊断中的价值。方法以快速免疫色谱法（ＩＣＴＴＢ卡） 检测结核分支杆菌５ 种单体蛋白的抗原性，观察其在结核病诊断中的敏感性和特异性，并与ＰＰＤ 皮试及脂阿拉伯糖甘露糖（ＬＡＭ） 相比较。结果　ＩＣＴＴＢ 卡、ＬＡＭ 及ＰＰＤ皮试诊断结核病的敏感性分别为５５．９％ 、５２．６％ 、７５．０％ ，后者与前二者间差异均有显著意义（ Ｐ＜０ ．０５）；ＩＣＴＴＢ卡、ＬＡＭ、ＰＰＤ皮试诊断肺结核的特异性为８７ ．６％ 、６２．９％ 、６８．９％ ，前者与后二者间差异均有非常显著意义（ Ｐ＜ ０．０１）；ＩＣＴＴＢ卡诊断肺结核病的临床阳性预计值为８８ ．５％ ，临床阴性预计值为５３ ．８ ％ ；非结核病例中的ＩＣＴＴＢ阳性主要由抗原４、５ 阳性所致，如果去除抗原４ 、５，那么ＩＣＴＴＢ诊断结核病的特异性将提高到９８．９％ 。结论　血清结核分支杆菌单体蛋白抗原性的测定是肺结核病一项有用的辅助诊断手段。     

结核分支杆菌热休克蛋白65kD在大肠杆菌中表达

目的　构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白65kD的工程菌。方法 设计引物并PCR扩增,目的基因克隆并转化,重组子经酶切和自动测序鉴定,阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组65kD蛋白。结果 65kD蛋白编码基因约1.6kb,重组子单酶切和双酶切证明目的基因插入载体,3个测序反应覆盖99.1%目的基因;大肠杆菌表达重组65kD蛋白。结论 大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分支杆菌抗原的途径。     

结核分支杆菌基因文库的构建

目的建立结核分支杆菌基因文库，为其基因及抗原的鉴定分析进而评估它们在诊断、预防、耐药及致病性等方面的作用提供有效手段。方法结核分支杆菌Ｈ３７Ｒａ染色体ＤＮＡ经脱氧核糖核酸酶Ⅰ（ＤＮａｓｅⅠ）部分消化后从凝胶中回收４～８ｋｂ片段，两端接以ＥｃｏＲⅠ接头，并将其连接在λｇｔ１１臂，用噬菌体包装蛋白“包装”，再进行连续稀释，然后将不同稀释度的噬菌体转染宿主菌Ｙ１０９０。结果基因库效率为８５％，滴度为３×１０５ｐｆｕ／ｍｌ，共含１．３×１０５个重组体，平均插入片段长度为３．５ｋｂ。结论该基因库能提供足够的克隆以覆盖Ｈ３７Ｒａ基因。     

几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的　了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6 (E)、MPT64 (M)、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏 (DTH)反应的能力。方法 常规皮肤实验法 :灭活H₃₇R_v全菌体致敏豚鼠,皮肤试验以生理盐水为阴性对照,5UPPD标准品为阳性对照,0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM分别于背部皮内注射,注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm),取二者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5UPPD及0.8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA+0.4μgM、0.4μgA+0.4μgE、0.4μgE+0.4μgM,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧,每批6只,共3批。注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm),取二者的平均值。结果 常规皮肤试验0.8μgM、A、M+E及E+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异 (P＞0.05),而0.8μgE抗原及M+A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异(P＜0.05)。时间效应 :重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径24h平均直径显著高于48h平均直径 (P＜0.05),24h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后,结果与常规皮肤试验结果一致。结论 从试验结果看,重组ESAT6抗原及MTP64与Ag85A混合物诱发豚鼠DTH反应强于PPD。     

结核分支杆菌重组38000蛋白抗原诱导豚鼠迟发性超敏？…

探讨结核分支杆菌重组３８００抗原诱导豚鼠产生迟发性超敏反应的能力及影响因素。方法常规皮肤试验法：Ｈ３７Ｒｖ致敏豚鼠,皮试时以生理盐水为阻对照,５ＩＵＰＰＤ为阳性对照,０．１μｇ、０．２μｇ、０．４μｇｒ几ＵＸＥ ＵＫ ＨＣ ＭＷ ＩＹ ＴＭＤＦ,ＩＹ     

重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌感染的鉴别作用

目的 研究重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌感染的鉴别作用.方法 以不同分枝杆菌分别致敏豚鼠,致敏成功后给所有动物皮内注射重组结核分枝杆菌11 000蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)或胞内分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD-B),用双盲法记录注射后24 h和(或)48 h注射局部皮肤反应的纵、横径,计算其均值.结果 PPD或PPD-B对所有分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤反应均为阳性,局部硬结直径均大于10 mm;重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌活菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验为阳性,局部硬结直径依次为(14.7±2.0)、(9.3±3.8)、(18.7±2.4)和(14.8±4.2) mm,而对灭活结核分枝杆菌、卡介苗和其他非结核分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验均为阴性.结论 重组结核分枝杆菌11 000蛋白可有效鉴别结核分枝杆菌活菌感染和卡介苗接种、结核分枝杆菌死菌致敏以及其他非结核分枝杆菌的感染.     

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的　获得重组MPT64蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET15b MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20～30%,分子量约26kDa,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80%左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 +2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为94% (31/33)、63.7% (21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94% (31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88% (29/33)、66.7% (22/23)。结论 pET15b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

重组结核分枝杆菌蛋白筛查结核分枝杆菌感染的试验研究

.0,均P>0.05).38000蛋白皮肤试验阳性反应直径多为5～9 mm,PPD试验阳性反应直径多为5～14 mill.结论 38000蛋白有望用于MTB感染的筛查.     

重组结核分枝杆菌38kDa蛋白的表达、纯化和复性及免疫特性的研究

目的构建结核分枝杆菌38kDa的重组质粒,在大肠杆菌中表达、纯化和复性重组蛋白,并评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出psts1基因片段,连接到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签(His-Tag)纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构。结果构建了含38kDa重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白38kDa,其占细胞总蛋白的55%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构,经蛋白印迹证实重组蛋白能与结核杆菌多克隆抗体结合。结论具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原。     

结核分枝杆菌脂多糖的提取及其检测血清结核抗体的研究

目的 提取结核分枝杆菌（MTB）脂多糖抗原,检测结核血清参考品,评价其在血清学诊断中的价值.方法 将MTB菌体冰浴超声破碎,用酚/氯仿、氯仿/甲醇抽提除去蛋白和脂质,再用DNase I酶和RNase 酶作用除去DNA和RNA,得到初步纯化的脂多糖即LPS-1, LPS-1在去污剂Triton-X114作用后,分成含有阿拉伯甘露糖（AM）的水相即LPS-2和含有脂阿拉伯甘露糖（LAM）和脂甘露糖（LM）的有机相即LPS-3,以三种多糖作为抗原,通过ELISA方法检测结核阳性和阴性血清参考品.结果 LPS-1对结核血清参考品检测的敏感性为71.7%,特异性为96%,LPS-3的敏感性为43.9%（18/41）,而特异性达到100%.结论 脂多糖抗原检测血清结核抗体显示出较强的特异性,可望成为结核病血清学的诊断组合抗原之一.     

结核分枝杆菌脂多糖的提取及其检测血清结核抗体的研究

目的提取结核分枝杆菌(MTB)脂多糖抗原,检测结核血清参考品,评价其在血清学诊断中的价值。方法将MTB菌体冰浴超声破碎,用酚/氯仿、氯仿/甲醇抽提除去蛋白和脂质,再用DNase I酶和RNase酶作用除去DNA和RNA,得到初步纯化的脂多糖即LPS-1,LPS-1在去污剂Triton-X114作用后,分成含有阿拉伯甘露糖(AM)的水相即LPS-2和含有脂阿拉伯甘露糖(LAM)和脂甘露糖(LM)的有机相即LPS-3,以三种多糖作为抗原,通过ELISA方法检测结核阳性和阴性血清参考品。结果LPS-1对结核血清参考品检测的敏感性为71.7%,特异性为96%,LPS-3的敏感性为43.9%(18/41),而特异性达到100%。结论脂多糖抗原检测血清结核抗体显示出较强的特异性,可望成为结核病血清学的诊断组合抗原之一。     

重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFPlO-ESAT-6)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆人pQE30质粒，表达、纯化rCFPl0-ESAT-6蛋白，通过Western blot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型，建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体，并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30-CFPl0-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％，分子质量为26000，纯化后的蛋白纯度为98％，浓度为1.2g／L。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应。以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值 2s为正常界限值，以融合蛋白为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应；以PPD为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应。结论 pQE30-CFPl0-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFPl0-ESAT-6融合蛋白，该蛋白兼具CFPl0和ESAT-6两种蛋白的抗原性，能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体。本研究为rCFPl0-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。