藻酸钙复合自体软骨细胞修复羊膝关节负重区软骨缺损的实验研究

[目的]以中国山羊为动物模型,观察藻酸钙复合自体软骨细胞修复膝关节负重区软骨缺损的可行性。[方法]取羊肩关节软骨,分离、培养软骨细胞,蕃红"O"、 Giemsa及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对其进行鉴定。将自体软骨细胞与藻酸钙凝胶复合,修复山羊股骨髁负重区全层软骨缺损(直径6 mm),实验分为四组:(1)缺损旷置组:缺损内未植入任何组织;(2)骨膜覆盖组:自体骨膜覆盖缺损区;(3)藻酸钙+骨膜组:凝胶植入软骨缺损区,并用自体骨膜覆盖;(4)藻酸钙+细胞+骨膜组:藻酸钙复合自体软骨细胞植入软骨缺损区,自体骨膜覆盖;分别于手术后3、6个月取材,通过大体观察及组织学评分检测修复效果。[结果]软骨细胞复合物蕃红"O"、 Giemsa染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色结果均为阳性,将藻酸钙凝胶-软骨细胞复合物用于羊负重区关节面软骨缺损修复,从大体观察和组织学评分进行比较,发现各组均有不同程度的组织修复,藻酸钙+细胞+骨膜组效果最好,与其他组差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]藻酸钙凝胶-软骨细胞复合物结合自体骨膜覆盖,可较好修复山羊膝关节负重区软骨缺损。     

关节软骨源性多孔支架复合自体软骨细胞修复兔关节软骨缺损的长期疗效观察

[目的]对关节软骨源性多孔支架复合自体软骨细胞复合体修复兔膝关节软骨缺损的长期效果进行观察和评价。[方法]实验动物新西兰大白兔共10只,分两组:(1)关节软骨源性支架对照组:缺损内置入关节软骨源性支架;(2)关节软骨源性支架复合细胞组:缺损内置入关节软骨源性支架-自体软骨细胞复合体。手术后15个月取材做大体摄像,甲醛固定、10%EDTA脱钙,石蜡切片,采用四种组织化学染色法(HE、奥新兰(AB)、甲苯胺兰(TO)、藩红花"O"染色)和Ⅱ型胶原免疫组化染色,观察修复后的兔关节软骨组织细胞形态特征。[结果]关节软骨源性支架对照组,大体观察关节表面有凹陷。石蜡切片HE染色见未修复缺损处为梭形细胞,纤维软骨,缺损处AB、甲苯胺兰、藩红花"O"染色为阴性,Ⅱ型胶原染色为阳性;关节软骨源性支架复合细胞组,大体见关节软骨表面修复平整、光滑。常规HE染色镜下见软骨全层修复良好,为透明软骨细胞,可见软骨陷窝潮线排列结构。细胞外基质特染:AB、甲苯胺兰、藩红花"O",Ⅱ型胶原特种染色均为阳性。[结论]组织学观察结果发现,关节软骨源性支架组为纤维软骨组织结构,未能完全修复膝关节软骨缺损;而关节软骨源性支架复合细胞组关节软骨缺损修复良好,未见退变,具有软骨组织的特征。     

组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究

目的 探讨运用组织工程软骨植入修复兔胫骨平台外侧髁全关节软骨浅层缺损的可行性。方法 取2周龄乳兔软骨细胞体外培养传代至第3代后，与人胎盘I型胶原蛋白海绵复合后植入成年兔的胫骨体平台外侧髁浅层完全软骨缺损区，并设立空白对照组，分别于术后4、12和24周取材，观察修复效果。结果 实验组术后4周缺损表面未见明显的新生软骨形成；12周，缺损表面有少量的新生软骨形成，组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的，小蜂窝状结构，软骨细胞周围有软骨陷窝形成；24周，缺损表面的新生软骨较4、12周的新生软骨明显，表面光滑，且与周围组织结合紧密，但仍存在部分缺损尚未修复。组织学切片上可见软骨陷窝形成，并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。面对照组则均未见明显的修复。结论 制成的组织工程软骨对兔胫骨平台软骨浅层完全缺损有修复作用，但不能完全修复缺损。     

软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建组织工程软骨

目的观察皮下植入异体软骨细胞复合异种软骨微粒脱细胞基质(Cartilage microparticle acellular matrix,CMACM)和纤维蛋白胶(Fibrin glue,FG)为支架形成组织工程软骨的可能性。方法制备猪耳廓CMACM,体外培养成年兔的耳软骨细胞,将不同的混合物植人5只成年兔背部皮下。A组:异体软骨细胞复合CMACM和FG;B组:自体软骨细胞复合CMACM和FG;C组:CMACM和FG。将每只兔子背部皮肤均分为6个区,分别植入不同混合物各两个点,以备两次取材。观察并记录皮下植入体的形态变化,分别于植入后8周和12周取材,行组织学检测。结果A组和C组未能形成软骨样组织。B组8周可以形成软骨样组织,周围炎症细胞数量较多;12周时形成的软骨组织成分单一,周围没有炎症反应,类似于正常软骨,且新生的软骨组织中均长有许多小血管,新生软骨的厚度不超过1 mm。结论将同种异体软骨细胞复合CMACM和FG植入皮下,不能形成软骨样组织:而以自体软骨细胞为种子细胞则可以得到软骨样组织,但新生软骨的体积和厚度有限,并且新生的软骨组织中长有许多小血管,可能更有利于新生软骨组织的长期存活。     

动物源性骨软骨支架修复兔膝关节复合缺损

目的探讨软骨细胞-动物源性骨软骨支架复合体修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性和影响因素。方法将改良贴壁离心法获取的骨髓间充质干细胞（bone marrowm esenchymal stem cells,BMSCs）/诱导分化的软骨细胞共培养后与经深低温冷冻、脱脂、脱钙、真空冷冻干燥和辐照消毒的动物源性骨软骨支架复合,构建共培养细胞＋软骨-骨一体化复合支架。27只新西兰大白兔随机分为实验组（A组）、对照组（B组）和空白组（C组）,每组9只。于兔股骨髁间窝处钻一深6mm的骨软骨复合缺损,A组植入共培养细胞＋骨软骨复合支架,B组植入骨软骨复合支架,C组不植入任何支架材料和细胞,分别于术后4周、8周和12周取材,行大体观察、苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色,并对各标本的软骨切片进行组织学评分。结果随着时间的延长,A组大体观察见复合缺损区已完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合;B组新生组织仍不能完全填充缺损;C组缺损区仍明显。苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色见A组软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞呈柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好;B组新生软骨细胞无软骨陷窝,排列混乱,各界面藕合欠理想;C组可见陈旧性肉芽组织生长并突出于缺损区表面。甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分结果表明,A组与B、C两组之间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 BMSCs/诱导分化的软骨细胞共培养细胞复合动物源性骨软骨支架对兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损具有修复作用。     

兔骨髓间充质干细胞修复膝关节软骨缺损的实验研究

目的研究由同种异体兔骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化的软骨细胞和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)双层支架构建复合体对兔软骨缺损的修复作用。方法用密度梯度离心法和贴壁培养法获得5月龄兔骨髓来源间充质干细胞,在体外培养并进行分化诱导后作为种子细胞复合双层PLGA构建成复合体。36只兔在股骨髁间制造骨软骨缺损模型,分成三组,A组植入复合体,B组植入单纯双层PLGA支架,C组植入自体骨软骨。第24周取材进行大体观察、组织学检查和Wakitani评分。结果 A组及C组植入物愈合良好,组织学检查见Ⅰ、Ⅱ型胶原纤维形成。A组可见透明软骨修复。Wakitani评分A组2.75,B组7.00,C组1.98,A、C组与B组间统计学分析单项指标得分差异有统计学意义(P0.05),A组与C组间差异无统计学意义(P0.05)。结论诱导兔MSCs+PLGA双层支架能较好地修复兔膝关节骨软骨损伤。     

脱细胞软骨支架材料修复兔关节软骨缺损

目的 观察异种异体脱细胞软骨支架材料(ACM)复合同种异体兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果.方法 (1)密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSCs,选择第3代BMSCs作为种子细胞;(2)利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;(3)3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4 mm,深3 mm砌关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,Ⅰ ACM-BMSCs组:第3代BMSCs 1×106个/ml与ACM于37℃5%CO2饱和湿度复合48 h;Ⅱ ACM组;Ⅲ空白对照组.(4)移植6、12周后大体及组织学观察,免疫组织化学染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果.结果 (1)大体观察及组织学观察:6和12周Ⅰ组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨.Ⅱ组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞.Ⅲ组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;(2)Wakitani组织学评分可见在不同的时间段I组和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组间组织学评分差异无统计学意义(P>0.05).(3)免疫组织化学:ACM-BMSCs组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性.结论 以ACM为支架材料,同种异体BMSCs为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织.     

关节软骨缺损修复研究进展

关节软骨缺损是临床常见疑难病症之一。滑膜关节表面缺损后难以修复。现就关节软骨缺损的自发修复、自体或异体移植修复、软骨膜或骨膜移植修复、软骨细胞移植修复，以及三维立体细胞培养及组织工程技术修复等五个方面，综述了滑膜关节软骨缺损修复重建的方法学进展     

聚乙烯醇联合藻酸钙与兔软骨细胞共培养对兔膝关节软骨缺损修复的影响

目的 探讨聚乙烯醇联合藻酸钙(PVA/CaAlg)与兔软骨细胞(ATDC-5)共培养对兔膝关节软骨缺损修复的影响,以及对胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的mRNA表达及Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 将20只成年新西兰兔随机分为实验组与对照组,每组10例,在右膝关节软骨造缺损模型.将从4周龄新西兰兔膝关节组织中收集的ATD...     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

组织工程化软骨修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的 评估同种异体组织工程软骨修复兔膝关节全层软骨缺损的有效性。方法分离收集成年新西兰大白兔软骨细胞进行体外培养。建立双侧兔膝关节软骨缺损模型，用去端肽胶原（atelocollagen）凝胶与所培养的异体兔关节软骨细胞共同植入兔膝关节软骨缺损处，并设对照组。分别于手术后4周、8周观察大体标本以及组织学修复结果，并进行Wakitan的评分，评估此方法的有效性。结果大体观察结果表明，与对照组相比，实验组缺损处由软骨组织修复而对照组缺损处由纤维样组织填充。组织学观察可以见到实验组关节软骨缺损处有密集的软骨细胞而对照组关节缺损处只有纤维细胞无软骨细胞。结论通过短期观察表明以同种异体软骨细胞-去端肽胶原复合物修复全层软骨缺损的方法是有效可行的，为其进一步临床应用提供了参考。     

组织工程技术修复兔气管软骨缺损的实验研究

目的探讨以兔耳廓软骨细胞(auricularchondrocytes)为种子细胞,利用组织工程技术修复其自体气管软骨缺损的可行性。方法取兔耳廓软骨,以II型胶原酶消化分离软骨细胞,体外培养并扩增至第2代后,接种于聚羟基乙酸(PGA)纤维支架(3cm×2cm,约60mg),形成细胞—材料复合物。体外培养7d后,细胞—材料复合物环行包裹于直径为0.7cm的硅胶管外表面,置于裸鼠皮下。6周后取出,并将形成的管状软骨用于修复兔自体约1.5cm长的节段性气管软骨全层缺损。结果兔耳廓软骨细胞有较强的体外增殖能力,扩增至第2代时即可满足组织构建所需要的细胞量。软骨细胞种植于PGA后,细胞和材料黏附良好,细胞外基质分泌旺盛。置于裸鼠皮下6周后,细胞—材料复合物可形成弹性、韧性良好的管状软骨;其大体外观,组织学结构均与兔自体气管软骨相似。修复兔气管缺损后,组织工程化气管和周围组织愈合良好,实验动物可自主呼吸,成活1~28d不等,平均12.3d,死亡原因多为痰液积存和气管内肉芽增生。结论以兔耳廓软骨细胞与PGA相复合,利用组织工程学技术可以形成大体外观、组织学结构均与兔自体气管软骨相似的“组织工程化气管”,并能用于修复兔自体气管全层缺损。     

骨髓基质干细胞与纤维蛋白胶复合修复陈旧性关节软骨缺损的实验研究

目的建立组织工程方法修复陈旧性关节软骨缺损的动物模型,研究骨髓基质干细胞(BMSCs)与纤维蛋白胶(FG)的混合物修复陈旧性关节软骨缺损的效果。方法在新西兰大白兔股骨髁关节面制造圆形缺损,每孔直径4mm,深度约3mm,达松质骨。术后12周利用自体BMSCs与FG混合物进行修复。将36只兔共72侧膝关节随机分为空白对照组、陈旧修复组、新鲜修复组3组。术后分别在4、8、12、24、32和48周取材进行大体、组织学观察,参照Pineda标准对新生组织评分对比缺损修复的情况及新生组织的类型。结果陈旧组与新鲜组两种混合物修复组在甲苯胺蓝变色反应表明其与周围正常软骨无明显区别,均为类透明软骨组织修复。而对照组12周时为纤维软骨修复,后期为纤维组织和板层骨修复。陈旧组与新鲜组各期平均组织学和组织化学得分差异无显著性意义(P>0.05),但均高于对照组(P<0.05)。Pineda评分后数据做方差分析,8、12和24周陈旧组与新鲜组比较差异无显著性意义(P>0.05),这两组在第4周比较差异有显著性意义(P<0.05)。陈旧组与新鲜组2～48周期间关节功能良好。结论陈旧性关节软骨缺损和新鲜缺损应用BMSCs与FG复合修复的效果无明显差异。明确了BMSCs与FG的混合物在短期内能够良好地修复陈旧性关节软骨全层缺损,长期效果还有待研究。     

应用骨形态发生蛋白(BMP)修复关节软骨缺损的实验研究

目的探讨关节软骨全层缺损应用骨形态发生蛋白修复的效果。方法于2004年5月至2005年12月,30只新西兰种成年兔随机分为A,B,C三组,每只兔子左膝股骨髁间凹做一大小为4mm×5mm×2.5mm的全层关节软骨缺损。A,B组缺损内分别填充骨形态发生蛋白/纤维蛋白胶(BMP/FG)及FG,C组为空白。术后28周对缺损修复情况行大体形态、组织学和电镜观察。结果BMP/FG组,缺损组织以透明软骨修复,接近正常组织,而FG组和空白组则以纤维组织修复为主。结论BMP/FG能较好的完成关节骨软骨全层缺损的修复,并随着时间的延长修复的软骨越接近正常软骨,但修复软骨缺损的组织与邻近正常软骨组织连接性仍不是十分理想。     

大鼠软骨细胞与兔软骨细胞的培养与比较

目的 体外分离培养大鼠及兔膝关节软骨细胞,观察并比较两种软骨细胞的培养特点。方法 采用机械-酶消化法处理SD大鼠幼鼠和新西兰兔的软骨组织,传代培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数法测定生长曲线,实时定量PCR测定不同代数的软骨细胞Ⅱ型胶原与含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS5）表达水平,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色对细胞进行鉴定。结果 原代培养大鼠软骨细胞12 h,内贴壁成多角形或不规则型,排列成“铺路石”状,培养3~5 d后进入快速增殖期,1周后进行细胞传代培养。兔软骨细胞相对贴壁缓慢,生长滞后。两类软骨细胞随着培养代数的增加,Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达量逐渐减少,ADAMTS5的表达逐代升高,表明随着培养代数的增加,软骨细胞活力逐渐下降。相同代数的大鼠软骨细胞活性较兔软骨细胞更高。甲苯胺蓝染色可见大鼠软骨细胞内成蓝色异染的糖胺多糖成分。不同波段的荧光激发下,Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色可见大鼠原代培养的软骨细胞胞浆和胞膜呈清晰的绿色荧光,兔软骨细胞呈红色荧光,细胞核为明亮的蓝色荧光。结论 本实验通过比较大鼠及新西兰兔软骨细胞的培养与特点,证实随培养代数增加,软骨细胞活性逐渐降低,且相同代数大鼠软骨细胞较兔软骨细胞具备更高活性。     

Cryopreserved articular chondrocytes grow in culture, maintain cartilage phenotype, and synthesize matrix components

For osteochondral allograft transplantation to be successful, chondrocytes must survive preservation and retain their capacity to produce normal matrix components: proteoglycans and Type II collagen. Clinical success with osteochondral allograft transplantation has created an increased demand for supplies of suitable cartilage-bearing grafts. This demand has stimulated attempts to find successful methods for low temperature storage of cartilage for "banking" and heightened interest in cartilage cryobiology. In order to achieve the maximum viability of cryopreserved articular cartilage, previous comprehensive studies have focused on rates and temperatures of freezing, cryoprotective agents, and methods and influences of thawing. This study presents evidence that cryopreserved articular chondrocytes maintain their ability to grow in tissue culture following thawing and to produce normal matrix components. Chondrocytes isolated from Japanese white rabbits were divided into groups of fresh controls and experimental cryopreserved cells. Cells were incubated in dimethylsulfoxide, frozen at a rate of -1 degrees C/min, stored at -79 degrees C, rapidly thawed, and plated for culture. Growth rates were comparable in all groups. In all groups, typical chondroid characteristics were maintained throughout 14 days of culture. Typical cartilage phenotypic characteristics included maintenance of polygonal and rhomboidal cells, cell aggregation, proteoglycan production, and Type II collagen synthesis. This investigation strongly indicates that articular chondrocyte cryopreservation yields viable, functional cells and although these results cannot be directly extrapolated to intact adult articular cartilage, they do give further support for low temperature banking of cartilage-bearing allografts for transplantation.     

Microinjury to the synovial membrane may cause disaggregation of proteoglycans in rabbit knee joint articular cartilage

Proteoglycans (PGs) isolated from articular cartilage (AC) of mature rabbits subjected to two or more consecutive intraarticular (IA) injections of sterile saline 24 h apart showed an aggregation defect in the presence of excess hyaluronic acid (HA). Although the PG contents of experimental and control cartilages were indistinguishable, a higher proportion of PGs were extractable from the 3 X IA tissues, as assessed by uronic acid analysis. Proteoglycans from experimental and control cartilages when examined by Sepharose CL-2B chromatography showed two subunit populations, the smaller (KAV = 0.70) containing more ketatan sulphate than the larger (KAV = 0.31). Cultures of AC from IA joints released more 35SO4-labelled PGs into the media over 72 h than control tissues and consisted mainly of PG degradation products although 20% could aggregate in the presence of HA. Examination of PG aggregation 2 weeks after 2 X IA or 3 X IA injections showed that the defect initiated was still present; however, cartilage of immature rabbits was not affected by the 2 X IA procedure.     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法 用５个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果 ⑴软骨块在４℃下,３ｄ内细胞存活率可达９３．４％～９７．６％。⑵原代细胞为圆形或三角形;第４代有一半转变成梭形,到第６代全部变为长梭形。⑶传代细胞贴壁时间（２～３ｈ）短于原代（４～７ｈ）。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为７８．７％～８５．５％,原代８．８％。⑷