稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系。方法:CaC l2法将pEGFR-EGFP质粒转化DH5α,酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHO-K1细胞;以EGFP作为荧光报告分子,克隆化培养以获取单克隆阳性细胞;流式细胞术、荧光显微镜术、W estern B lot检测转染细胞EGFR-GFP融合蛋白的表达;比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长曲线;反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFR-GFP融合蛋白的稳定性。结果:获得1株稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,命名为CHO-EGFR-GFP1,融合蛋白主要表达于细胞膜。稳定转染细胞和未转染细胞生长特性无显著差异。结论:成功获得膜表面稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,为研制以EGFR为靶点的抗肿瘤药物以及研究EGFR与其配体间相互作用奠定了基础。     

HBsAg/HCcAg融合表达细胞系的建立

目的 建立融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的体外培养细胞系，使之作为细胞杀伤实验的靶细胞。方法 将含HBV S和HCV C融合基因真核表达质粒CSpcDNA3.1用电穿孔法转染p815细胞，G418筛选后，再用有限稀释法进行单细胞克隆筛选。RT－PCR与免疫荧光法分别检测基因转录与蛋白表达。结果 HBV S基因与HCV C基因的RT－PCR检测均为阳性，HBV表面抗原与HCV核心蛋白的免疫荧光检测均为阳性。结论 成功获得融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的细胞系。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

表达载脂蛋白E-增强型绿色荧光蛋白的细胞系支持感染性丙型肝炎病毒的组装

目的 探讨表达载脂蛋白E-增强型绿色荧光蛋白(apolipoprotein E-enhanced green fluorescence protein,apoE-EGFP)的细胞系是否支持感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的组装.方法 利用shRNA基因沉默技术建立apoE稳定下调的Huh7.5.1细胞系,然后通过基因工程技术在该细胞系中建立稳定表达apoE-EGFP融合蛋白的细胞系.将HCV RNA转染进入野生型细胞(Huh7.5.1细胞)、对照组sh-NT细胞(转导非靶向野生型细胞基因的shRNA质粒的细胞)、apoE下调的Huh7.5.1细胞(sh-apoE细胞)以及表达apoE-EGFP融合蛋白的sh-apoE细胞(apoE-EGFP细胞)中,收集病毒液;通过半数组织培养感染剂量(TCID50)方法检测释放到Huh7.5.1、sh-NT、sh-apoE和apoE EGFP细胞培养上清液中的HCV的滴度.利用免疫荧光技术检测apoE与HCV的结构蛋白E2的相互作用,利用蛋白质印迹法检测用具有特异亲和性FLAG-gel纯化的HCV颗粒表面的apoE-EGFP的表达.结果 apoE-EGFP融合蛋白在apoE-EGFP细胞系中高效表达;apoE-EGFP细胞来源的HCV的感染性与Huh7.5.1、sh-NT细胞相比差异无统计意义;在apoE-EGFP细胞系中,apoE-EGFP融合蛋白与HCV结构蛋白E2存在共定位,并且可以在HCV颗粒表面上检测到apoE-EGFP融合蛋白.结论 apoE-EGFP融合蛋白是HCV颗粒的组分,apoE-EGFP细胞系支持感染性HCV颗粒的组装.     

丙型肝炎病毒E2及preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ基因与ｐｒｅＳ２基因嵌合，嵌合基因免疫小鼠能产生抗ＨＣＶＣ蛋白的抗体，而单独接种ＨＣＶＣ基因则不能诱导小鼠产生抗Ｃ蛋白的抗体［１］。为研究ｐｒｅＳ能否增加ＨＣＶＥ２蛋白的免疫原性提供物质基础，我们在哺乳动物细胞稳定表达了Ｅ２?..     

丙型肝炎病毒core-Ant融合表达

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）core对肝细胞的转分化作用,构建可以表达HCV core—Ant融合蛋白的原核表达载体．方法：已经构建的HCV core cDNA克隆质粒为模板,用PCR技术删除终止子,通过T载体克隆法构建pGEM—T-HCVcorecDNA克隆质粒．经筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序后,通过常规分子生物学亚克隆方法,利用已有的pGEMT-Ant载体,连接Ant和HCV core cDNA在同一ORF,插入到pTE28表达载体,建立了表达HCV core和果蝇穿膜肽Ant的融合蛋白表达克隆．使用IPTG诱导方法,从表达菌中提取包涵体蛋白,复性后使用ELISA方法检测表达蛋白的抗原性．使用HRP标记的抗HCV核心抗体免疫组织化学一步法检测HCV core和HCV core—Ant融合蛋白对N1H3T3细胞的转导能力．结果：pGEM—T—HCV core—Ant cDNA克隆的酶切物理图谱及测序证实结果证实建立了果蝇穿膜肽Ant cDNA克隆和删除了终止子的HCV core cDNA克隆．亚克隆后建立的重组质粒pTE28HCVcoreAnt经限制性内切酶后,琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和设计预计值一致．序列测定结果表明HCV core cDNA和穿膜肽AntcDNA处于同一ORF．通过转化BL21 DE3表达菌,IPTG诱导后,PAGE电泳成功表达了HCV core—Ant蛋白．复性后包被酶标板,间接ELISA方法检测抗HCV抗体阳性血清和正常人血清证实表达蛋白具有敏感和特异的抗原性．目标蛋白能转导进入NIH 3T3细胞显示了大量的阳性着色细胞．这些阳性着色细胞的着色颗粒主要存在细胞质中．表明构建表达HCV core—Ant融合蛋白的pET28原核表达载体成功．结论：通过分子克隆体外重组技术成功建立了表达HCV core—Ant的pTE28原核表达载体,为研究HCV core对细胞的转分化作用和HCV的致癌机制奠定了基础．     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因,并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中,再与表达载体ｐＭＳＧ重组,以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞,经地塞米松（ＤＭ）诱导,采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

小鼠重组釉蛋白基因稳定表达细胞系的建立

目的:构建小鼠重组釉蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系.方法:取初生小鼠牙胚组织,提取 RNA,用 RT-PCR 技术扩增釉蛋白基因片段,经双酶切后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1^TM/myc-His(-)B 上, 转化大肠杆菌E.coli DH5α, 中提质粒,将该重组表达质粒转染至 HEK 293A 细胞,用 G418 筛选出阳性克隆,并检测釉蛋白的表达水平.结果:通过测序表明,小鼠釉蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上.将该表达系统转染 HEK 293A 细胞后,进行 Western Blot 检测,证明其中有相对分子质量约 32 000 的釉蛋白表达.结论:成功构建了小鼠重组釉蛋白真核表达载体,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础.     

稳定表达人巨细胞病毒pUL49蛋白人胚肺成纤维细胞系的建立

目的 用逆转录病毒载体介导的基因转移方法,建立稳定表达人巨细胞病毒(HCMV)UL49基因的HELF细胞系.方法 首先应用KT-PCR从感染HCMV的HELF细胞RNA中扩增UIA9基因,克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1上,以此构建重组逆转录病毒栽体pLEGFP-N1-FLAG-uL49,并转染AmphoPackTM-293细胞,收集逆转录病毒,感染HELF细胞,经G418抗性筛选出阳性细胞.结果 经IFA、KT-PCK及Wcstem blot检测到UIA9基因在稳定细胞系中表达.结论 HELF-PLEGFP-N1-FLAG-UL49稳定细胞系构建成功.此细胞系为进一步研究HCMV pUL49蛋白的功能提供了一个有力工具.     

丙肝病毒核心蛋白抑制乙肝病毒转录与复制的实验研究

目的观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)对乙型肝炎病毒(HBV)基因转录和病毒复制的影响。方法将不同剂量的HCVcore表达质粒(pNKF-HC Vcore)转染HepG2.2.15细胞。以空载质粒(pNKF)转染HepG2.2.15细胞作为阳性对照,转染HepG2细胞作为阴性对照。以Northern吸印杂交检测HBV mRNA的转录水平,以Southern吸印杂交检测HBV复制中间体DNA的复制水平。结果20μg pNKF-HCV core转染HepG2.2.15细胞后,可使细胞中HBV mRNA转录水平及HBV复制中间体DNA复制水平明显降低,抑制率分别为51.9%及36.5%。10μg及15μg pNKF-HCV core较pNKF转染的HepG2.2.15细胞的HBV mRNA信号与HBV复制中间体DNA检出信号强度无显著差异。结论HCV核心蛋白达到一定的剂量后能够在一定程度上抑制HBV的转录与复制。     

HCV 5′UTR调控GFP真核表达质粒的构建及表达

目的构建丙型肝炎病毒5′非翻译区（HCV 5′UTR）调控绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法通过PCR扩增，获得HCV基因组HCV 5′UTR完整序列及C区序列的部分基因片断。将此片断插入pEGFP-NI载体多克隆位点区，构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒．应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光。结果成功构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论该载体的成功构建，可以用于直观地评价针对HCV 5′UTR的基因药物的效果。     

HCBP1的细胞定位及与HCV核心蛋白在体内的相互作用

目的探讨HCV核心蛋白与（HCBP1）HCV核心蛋白的相互作用蛋白在真核细胞内的相互作用。构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与HCBP1融合蛋白真核表达载体,分析其在COS．7细胞中的表达和亚细胞定位。方法PCR分别扩增含HCV核心及HCBP1的eDNA片段,克隆人pGEMT载体,经测序正确后,分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平。将HCBPl的eDNA片段克隆人绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,转染COS-7细胞,以Westernblot和荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其细胞定位。结果CAT．EUSA检测显示pM-核心蛋白与pVP16-HCBP1实验孔吸光度值高于其他阴性对照,但低于阳性对照组。成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,Westernblot证实融合蛋白在转染细胞中的表达,荧光显微镜示HCBPl．EGFP融合蛋白分布于细胞浆,而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变。结论成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白表达载体,并在COS-7细胞中得到表达。哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1确有一定的相互作用。     

绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

过表达ERCC1蛋白细胞系的建立

[目的]建立过表达ERCC1蛋白的细胞系，为遗传毒性化合物的研究提供模型细胞系，并有可能为具有DNA加合作用化合物提供新的毒理学筛选方法。[方法]应用PCR和DNA重组技术将核苷酸切除修复交叉互补组1(Excision repair cross complementation groupl，ERCCl)基因与pT7Blue载体相连接，然后构建真核细胞重组表达质粒pcDNA3．1／Zeo( )-ERCC1，并导入293细胞。经Zeocin抗性筛选后获得转染ERCC1基因的细胞克隆。细胞增殖后以Western-blot检测目的蛋白的表达。[结果]获得稳定转染ERCC1基因的细胞系，并在细胞中检测出有ERCC1蛋白的过表达．[结论]用基因转染法成功建立了过袁达ERCC1蛋白的ERCC1-293细胞系。     

丙肝病毒感染对C反应蛋白表达的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)在体内外对C反应蛋白(CRP)表达的影响。方法收集武汉大学中南医院2015年1月至2016年2月HCV感染患者标本106例和健康体检者标本110例,免疫透射比浊法检测其血清CRP水平,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV感染的Huh7.5.1细胞及其对照细胞中CRP mRNA的表达。结果 HCV感染患者血清CRP水平为(8.62±5.56) mg/L,显著高于健康体检者的(1.35±0.71) mg/L,差异有显著统计学意义(P<0.01);HCV感染的Huh7.5.1细胞中CRP mRNA的表达水平较对照细胞高,其CRP/β-actin灰度比值分别为0.31和1.5。结论 HCV感染能够上调肝细胞CRP的表达。     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞 …

目的 构建丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｐｒｅＳ融合蛋白的真核表达载体。方法 用ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,用脂质体转染试剂将其转入ＣＯＳ７细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白,结果Ｅ２－ｐｒｅＳ融合蛋白基因包括了全长的ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,嵌合基因长度约１．６ｋｂ表达载体在ＣＯＳ７细胞表达出     

TNF-SP-EGFP融合蛋白的构建表达及亚细胞定位

目的探讨肿瘤坏死因子信号肽（TNF-SP）在哺乳动物细胞的表达和亚细胞定位。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术，以TNF-SP-pcDNA3.0质粒为模板扩增TNF-SP基因，采用PCR产物的粘端克隆法，将TNF-SP定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点，构建TNF-SP-EGFP重组质粒，酶切，PCR检测，序列分析鉴定，采用脂质体转染法，将TNF-SP-EGFP融合基因转染COS-7细胞进行表达，经碘化丙啶（PI）染色后以激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果PCR检测，酶切鉴定及测序证实目的基因TNF-SP正确连接到pEGFP-N1的多克隆位点。TNF-SP-EGFP重组体转染COS-7后，激光共聚焦显微镜显示TNF-SP-EGFP在细胞质表达。结论成功地构建了TNF-SP-EGFP融合蛋白真核表达质粒，在COS-7细胞中获得表达，并证实其定位于细胞质。     

筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4B慢病毒LO2稳定株差异表达基因和基因通路

目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) 1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据.方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2-mkate2复苏扩增;应用Human Gene 1.0ST芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因.基于京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行显著性分析.应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶Cδ结合蛋白(protein kinaseC delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物Ⅰ(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列(baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平.结果:以LO2-NS4B与LO2-rnkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上调和1 236个基因表达下调.上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通路、Wnt信号通路和细胞周期通路等.Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60％.结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和细?     

丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用

目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）Ｅ２ 包膜蛋白,并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测ＨＣＶＲＮＡ 阳性血清中Ｅ２ 抗体,研究其检测Ｅ２ 抗体的敏感性和特异性。方法：将ＨＣＶＥ２ 蛋白基因克隆到原核表达载体中,并转化大肠杆菌。用ＩＰＴＧ 诱导细菌表达Ｅ２ 蛋白,经离子交换层析纯化蛋白。用纯化的包膜蛋白包被微孔板,经ＥＬＩＳＡ方法检测ＨＣＶＲＮＡ阳性血清中的Ｅ２ 抗体。结果：在大肠杆菌表达了相对分子质量为４５ ０００ 的可溶性Ｅ２ 蛋白,占细菌总蛋白量的２１％ ,纯化后,蛋白纯度为８５％ 。用其检测ＨＣＶ 患者血清１７１ 例,Ｅ２ 抗体的检出率为６３％ 。在Ｅ２ 抗体阳性的血清中,部分为抗ＨＣＶ 阴性。结论：Ｅ２ 蛋白的表达及初步纯化的成功,可能用于临床检测。各基因型ＨＣＶＥ２ 包膜蛋白的抗体之间有交叉反应,在目前的抗ＨＣＶ 诊断试剂中加入可溶性、非融合Ｅ２ 包膜蛋白,可以改善抗ＨＣＶ 诊断试剂的特异性和敏感性。     

丙肝病毒核心抗原荧光定量型生物条形码检测体系的建立与评价

目的建立丙肝病毒核心抗原（HCVcAg）的荧光定量型生物条形码检测体系,并对检测体系进行方法学评价。方法制备标记有HCVcAg多抗及特异DNA链的金纳米颗粒探针（NP探针）和标记有HCVcAg单抗的磁性微球探针（MMP探针）,形成MMP探针-HCVcAg-NP探针复合物,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过荧光定量PCR方法鉴定这些释放的DNA链可确定丙肝病毒的存在。结果建立了HCVcAg的荧光定量型生物条形码检测体系,检测灵敏度可达100fg/ml,是相应的HCVcAg ELISA检测方法的104倍。结论本研究为发展高灵敏度丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒奠定了基础。