软骨细胞体外分离培养与鉴定的实验研究

目的探讨兔关节软骨细胞分离、培养和鉴定的方法，建立软骨细胞的体外培养体系。方法4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法，分离膝关节软骨细胞接种培养以及传代培养．倒置相差显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定。结果成功建立了体外培养软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性。细胞传至5代后．出现“成纤维细胞样”。结论本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法；初代、第2代、第3代细胞生长良好，适合于实验研究；软骨细胞5代培养后．细胞袁型发生改变。     

兔关节软骨细胞的分离、培养和形态学特征

[目的]探讨兔关节软骨细胞的分离、培养方法,观察单层高浓度培养时细胞表型表达情况.[方法]无菌条件下,从 2周龄新西兰白兔的颞颌关节及四肢关节髁突面削取软骨片,采用机械-酶消化法分离软骨细胞,经台盼蓝拒染计数,将细胞按 1× 106个 /孔接种于 6孔培养板,传代培养,描绘生长曲线.利用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态.应用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定.[结果]每克软骨能获取 1 5× 106个软骨细胞,活性率为 95%.培养 2～ 3 d,细胞贴壁、变形,呈多角形; 8 d左右,细胞融合成层.透射电镜观察显示细胞核圆形,有丰富的粗面内质网、高尔基体及分泌的基质成分.甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性.细胞传至 5代后,出现"成纤维细胞样".[结论]本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法;初代、第 2代细胞生长良好,适合于实验研究;软骨细胞 5代培养后,细胞表型发生改变.     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

透明质酸凝胶中肌源性干细胞与透明软骨联合培养的实验研究

 摘　要：目的 探讨肌源性干细胞与软骨细胞混和培养体外成软骨的可行性。方法 分离培养、扩增传代兔MDSCs及关节软骨细胞,二者按一定比例混和,6×1010/L密度接种于5%浓度的透明质酸凝胶为共培养组,以相同密度的单纯MDSCs和单纯软骨细胞作为阴性与阳性对照。倒置相差显微镜下观察,10d后行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达。结果 5d后镜下见共培养组MDSCs形态由梭形向多边多角形转化,10d后细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测与阳性对照组相同,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达。阴性对照组在体外培养过程中未分化为软骨细胞. 结论:软骨微环境在MDSCs成软骨分化过程中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导MDSCs向软骨样细胞分化,透明质酸凝胶可以作为软骨组织工程的良好载体。     

兔关节软骨细胞的分离培养及生物学特征

目的 探讨兔关节软骨细胞分离培养的方法和生物学特性。方法 从4周龄新西兰白兔关节分离培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代培养的细胞形态学变化,并计数绘制生长曲线。测定细胞冻存复苏后的存活率。用甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法了解葡萄糖胺多糖（GAGs）,Ⅱ型胶原的合成情况并鉴定细胞。结果 成功建立体外培养兔关节软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形,传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定,冷冻复苏存活率为92％。结论 本文建立的体外培养关节软骨细胞的方法简单可行。体外培养的兔软骨细胞表型能保持3代稳定,具有良好的生物学活性,可用于实验研究,可经深低温冷冻保存。     

兔软骨细胞的分离与培养

目的 探讨免软骨细胞培养方法。方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右，传代培养约4～5天，细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖，异染反应主要集中在细胞集落样生长区，异染程度以原代培养最为显。结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。     

兔软骨细胞的分离及其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养实验研究

目的  探讨体外分离兔软骨细胞的方法并观察其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养时的生物活性。方法  取4周龄的新西兰大耳兔,处死后在无菌条件下取关节软骨。通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞。倒置相差显微镜下观察软骨细胞特点,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色。将第3代兔软骨细胞与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养,噻唑蓝（MTT）法和糖胺聚糖含量测定法检测软骨细胞在胶原膜上的细胞活性,扫描电镜观察软骨细胞在复合胶原膜上的生长情况。结果  分离出的原代软骨细胞初为卵圆形,贴壁后变成三角形或多边形,可被甲苯胺蓝染色。软骨细胞在Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜上生长良好。结论  两部酶法可获得大量软骨细胞,MTT法和扫描电镜证实软骨细胞可在复合胶原膜上正常扩增。

     

胰岛素样生长因子I与透明质酸对人胚关节软骨细胞表型的影响

目的：研究胰岛素样生长因子I(IGF-I)和透明质酸（HA）联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响，判断其稳定软骨细胞表型的效果。方法：分离培养人关节软骨细胞，从第4代开始，用hIGF-I和HA联合培养，通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、II型胶原和aggrecan免疫组化及RT-PCR判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第6代细胞为对照组。结果：IGF-I和HA联合培养的第8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡；RT-PCR显示II型胶原mRNA表达阳性而I型胶原mRNA表达阴性；甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒；II型胶原和aggrecan免疫组化见80％-92％的细胞染色呈阳性或弱阳性，平均灰度分别为85.92和116.23，均显著低于对照组，说明处理组染色较对照组增强。结论：IGF-I和HA联合培养的第8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型，为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。     

二维及微团培养法对软骨细胞表型的影响

目的：探讨二维及微团培养对软骨细胞表型的影响。方法体外高密度二维及微团培养方法培养兔软骨细胞,从细胞形态、细胞外基质表达情况分析软骨细胞表型的差异。结果高密度二维方案培养兔软骨细胞,2周后软骨细胞多层分布, HE染色显示细胞呈圆形,细胞间联系较密,阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌较少;微团培养方法培养兔软骨细胞,2周后形成肉眼可见的白色组织,HE染色显示细胞呈多边形,细胞较分散,阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌明显多于二维培养,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论微团培养方法培养兔软骨细胞,有利于软骨细胞分泌细胞外基质。     

新型快速成形的三维多孔支架材料构建组织工程软骨

目的:探讨以骨髓基质细胞(BMSC)为种子细胞,以快速成形的生物相容性材料为支架构建组织工程软骨的可行性.方法:成年兔BMSC在成软骨培养液中诱导培养,使之具有软骨细胞表型后,接种于快速成形的生物相容性三维支架材料聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA),经体外培养扩增2 wk后植入自体肌袋,术后8 wk取材,进行组织学、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组织化学观察.结果:成年兔BMSC在体外可诱导为软骨细胞,接种于三维支架材料培养后,扫描电境观察见细胞在支架上可大量扩增;接种细胞的支架植入自体肌袋8 wk,可形成软骨样组织,甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色阳性.结论:具有软骨细胞表型的BMSC接种于快速成形的三维支架材料在体内非关节环境可形成软骨样组织.     

透骨消痛颗粒对兔软骨细胞周期的影响

目的 观察透骨消痛颗粒对兔软骨细胞周期的影响. 方法 采用流式细胞仪检测透骨细胞颗粒干预后兔软骨细胞周期的变化. 结果 含药血清能够刺激软骨细胞由G0/G1期进入S期和G2/M期,干预48 h后,G0/G1期细胞比例降低,S期与G2/M期细胞之和增加,与空白组比较有显著性差异(P＜0.05). 结论 透骨消痛颗粒含药血清能有效地促进软骨细胞的增殖.     

移植的骨髓间充质干细胞在兔腰椎间盘内分化的研究

目的观察移植的骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内分化的情况。方法从兔骨髓中分离和培养骨髓间充质干细胞,用核标记物BrdU标记后注入到兔的椎间盘中,8周后取材采用双染的方法检测移植骨髓间充质干细胞的细胞质中Ⅱ型胶原蛋白的表达情况。结果移植后的骨髓间充质干细胞部分双染呈阳性显色,即胞质内含有Ⅱ型胶原蛋白,向软骨细胞方向分化。结论在椎间盘环境的影响下骨髓间充质干细胞可以分化为软骨样细胞。     

骨髓间充质干细胞构建组织工程半月板软骨种子细胞

目的使用特定细胞因子刺激诱导分离扩增后的兔骨髓间充质干细胞（Mesenchynml stem cells,MSCs）,在体外试验中使其分化为软骨细胞,为后续构建工程化半月板研究提供种子细胞,探讨兔MSCs重建半月板组织的可行性和有效性。方法用碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和转化生长因子β1（Transforming growth factor-βl,TGF-β1）协同刺激已分离并经体外传代培养扩增的兔MSCs,通过倒置细胞显微镜观察及免疫组化检测,证明其已经向软骨细胞系分化。结果用bFGF和TGF-β1协同刺激已分离并经体外扩增的兔MSCs后,细胞生长速度增快,免疫组织化学检测提示向软骨细胞系分化。结论兔MSCs可向软骨细胞分化;bFGF和TGF-β1能加快MSCs的体外增殖并促使其向软骨细胞系分化,可为构建工程化半月板提供理想的自体来源种子细胞。     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）在特定培养条件下向软骨细胞定向分化的情况。方法密度梯度离心法分离兔BMSCs，在体外培养扩增后用含有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP)-2的条件培养液诱导其在体外单层培养模式下向软骨细胞分化。采用甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫组织化学染色、阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量检测BMSCs分化情况。统计学分析比较第2、4、7代（P₂、P₄、P₇）BMSCs诱导后增殖能力及向软骨细胞分化能力的变化。结果定向诱导后BMSCs表现出软骨细胞的特性。P₂、P₄间的细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）；P₇与P₂、P₄相比，细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论BMP-2能诱导兔BMSCs在体外单层培养模式下向软骨细胞分化；细胞传代对BMSCs向软骨细胞分化有重要影响。     

川芎嗪对IL-1β诱导的兔原代软骨细胞iNOS表达和NO合成的影响

目的观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的兔原代软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达及一氧化氮(NO)合成的影响。方法体外培养兔软骨细胞,用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖,免疫荧光检测兔原代软骨细胞Ⅱ型胶原;用IL-1β10 ng/ml和(或)不同浓度(5、10、15、20μg/ml)川芎嗪共培养兔原代软骨细胞48 h后,RT-PCR和免疫组化检测iNOS基因及蛋白表达;用硝酸还原法检测细胞培养上清液NO的表达。结果软骨细胞呈三角形或多角形,蛋白多糖表达于细胞质中,Ⅱ型胶原主要表达于细胞质,少见于细胞核。与对照组比较,IL-1β单独作用软骨细胞iNOS和NO的表达显著增加(P<0.01);IL-1β和川芎嗪联合作用后,软骨细胞iNOS和NO的表达较IL-1β单独作用显著降低(P<0.05,P<0.01),但仍显著高于对照组(P<0.01)。结论川芎嗪能有效抑制IL-1β诱导兔软骨细胞iNOS的表达和NO的合成。     

维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的：观察维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的影响。寻找有效、安全、方便的药物以防治增增性玻璃体视网膜病变。方法：分别将不同浓度的维拉帕米加入体外的兔ＲＰＥ细胞,用噻唑蓝（ＭＴＴ）比色法在自动酶标测定仪测５４０ｍｍ处的吸光值Ａ「旧称光密度（ＯＤ）」,计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率及５０％抑制浓度,同时用２％台盼蓝色,测定细胞活性。结果：Ｖｅｒ在所设浓度范围内均明显抑制血清诱导的兔ＲＰＥ细胞的