梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达及在梅毒血清学诊断中的初步应用

目的克隆、表达梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白Tp0453，建立间接ELISA法，探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法构建重组质粒pQE32／Tp0453，IPTG诱导表达，SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达结果；Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测人血清中特异性IgG抗体。结果成功构建了重组质粒pQE32／Tp0453；SDS-PAGE检测诱导产物显示有一分子量约为32000的特异蛋白带，免疫印迹检测其只与Tp IgG抗体具有阳性反应；重组蛋白用作ELISA包被抗原检测Tp阴阳性参比血清，特异度和灵敏度均为100％；检测患者血清中特异性IgG抗体结果与TPPA法符合率为98．2％。结论表达的Tp043重组蛋白具有较好的免疫反应活性，可望用于梅毒的血清学诊断。     

肺炎嗜衣原体三种不同抗原的临床诊断价值评价

目的 研究肺炎嗜衣原体3种重组抗原Cpn0146、Cpn0147及Cpn0308应用于肺炎嗜衣原体感染血清学诊断中的价值.方法 构建pGEX6p-2/Cpn0146、Cpn0147、Cpn0308重组质粒,并诱导表达重组蛋白,采用间接ELISA法和免疫印迹法(Western-blot)分析其免疫原性及其免疫反应性.建立分别以3种重组蛋白为包被抗原的间接ELISA法,与肺炎嗜衣原体IgG商品诊断试剂盒平行检测183份呼吸道感染患者的血清标本及32份沙眼衣原阳性患者血清标本,比较各方法检出准确性及阳性率.结果 GST-Cpn0146、Cpn0147、Cpn0308免疫兔血清中特异性IgG抗体效价滴度分别达1:6 400、1:12 800和1:12 800以上;以3种重组蛋白为包被抗原的ELISA法准确性分别为92.3%、94.5%、96.7%.各方法检测出阳性率结果显示,Cpn0146组的阳性率为38.8%(71/183)、与肺炎嗜衣原体IgG试剂盒的阳性率比较差异有统计学意义(x~2=12.07,P<0.05);Cpn0147阳性率40.9%(75/183),与肺炎嗜衣原体IgG试剂盒的阳性率比较差异有统计学意义(x~2=8.10,P<0.05);Cpn0308阳性率44.8%(75/183),与肺炎嗜衣原体IgG试剂盒的阳性率比较差异无统计学意义(x~2=0.57,P>0.05).结论 Cpn0308在肺炎嗜衣原体感染血清学诊断实验中表现出良好的准确性(96.2%)和较高的阳性率(44.8%),可望用于进一步研制肺炎嗜衣原体诊断试剂盒.     

肺炎嗜衣原体Cpn 0147重组蛋白的免疫学活性研究

目的 研究Cpn 0147重组蛋白的免疫学活性及其应用于肺炎嗜衣原体(Cpn) 感染临床诊断中的价值.方法 采用GST琼脂糖凝胶纯化目的 蛋白,将Cpn 0147重组蛋白免疫新西兰兔,分别应用Western blot、ELISA法检测其免疫反应性及免疫原性,同时通过检测临床标本以评估其诊断价值.结果 成功表达并纯化了相对分子质量约41×103的重组蛋白GST-Cpn 0147;Western blot和ELISA结果显示,该重组蛋白具有良好的免疫反应性,动物实验结果表明该重组蛋白具有较好的免疫原性,ELISA结果显示该重组蛋白免疫新西兰兔血清抗体效价为1∶12 800.结论 Cpn 0147重组蛋白具有较好免疫学活性和特异性,可为Cpn感染的确诊、预防研究奠定基础.     

MgPa重组蛋白在生殖支原体血清学诊断中的应用

[目的]表达、纯化生殖支原体 （Mycoplasma genitalium,Mg） 黏附蛋白（MgPa）优势表位基因（MgPa＇,1075-1364aa）,探讨MgPa＇重组蛋白在Mg血清学诊断中的应用.[方法]IPTG诱导表达重组质粒pET-30a（＋）/MgPa＇,SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达结果;Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,间接酶联免疫吸附试验（Enzyme link immunosorbent assay,ELISA）检测人血清中特异性IgG抗体.[结果]SDS-PAGE检测诱导产物显示有一分子量约为37 000的特异蛋白带,免疫印迹检测其只与Mg抗血清发生特异反应;在311例有临床症状性传播疾病（STD）患者中用PCR法筛查出Mg阳性42例,阳性率13.5%（42/311）.重组蛋白用作ELISA包被抗原检测Mg阴阳性血清,重组蛋白能和Mg感染者阳性血清特异性结合,重组蛋白有良好的免疫反应性.[结论]表达的MgPa＇重组蛋白具有较好的免疫反应活性,可望用于生殖支原体的血清学诊断.     

梅毒螺旋体Tp0319重组蛋白的表达、纯化及其在临床诊断中的初步应用

目的克隆、表达及纯化梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白Tp 0319,并建立间接ELISA方法,探讨其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建重组质粒PQE32/Tp 0319,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和western blot鉴定表达结果;Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,间接ELISA检测梅毒患者血清中特异性IgG抗体。结果成功构建了PQE32/Tp 0319重组质粒;经SDS-PAGE检测,诱导产物显示有一条相对分子质量约为30 000的特异蛋白质条带,western blot分析证明其只与人抗Tp IgG发生特异性反应;将Tp 0139用于间接ELISA检测抗Tp抗体阴、阳性参比血清,特异性和敏感性均为100%;检测梅毒患者和健康献血者血清各150份,结果与TPPA法符合率为95.3%。结论制备的Tp 0319重组蛋白有较好的免疫反应性,可望用于临床梅毒血清学诊断。     

梅毒血清学诊断用抗原Gpd蛋白的重组表达及鉴定

目的 利用基因工程技术重组表达梅毒螺旋体Gpd蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用.方法 PCR扩增Gpd基因序列,构建表达载体pET-28b-Gpd,将表达载体转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)并以IPTG诱导蛋白表达,经镍柱亲和层析纯化后,利用质谱和免疫印迹法鉴定重组蛋白.以重组蛋白建立间接ELISA法,并检测20份TPPA阳性和20份TPPA阴性血清去评价其在梅毒血清学诊断中的应用.结果 PCR扩增出约1.1 kb的Gpd片段,成功构建重组质粒pET-28b-Gpd.表达的重组蛋白的相对分子质量约41×103,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%.质谱和免疫印迹分析证实重组蛋白为Gpd蛋白,并能够与梅毒患者血清发生免疫学反应.间接ELISA法测定TPPA阳性血清和TPPA阴性血清的符合率分别为95%(19/20)和100%(20/20).结论 重组Gpd蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性的免疫学反应,是一种可潜在应用于梅毒血清学诊断的新抗原.     

梅毒螺旋体硫氧还原蛋白TP0100的原核表达和鉴定

目的构建梅毒硫氧还原蛋白TP0100基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达重组蛋白,并评价其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建pET-28b-TP0100重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后诱导表达。经镍柱纯化,重组蛋白通过质谱和Western blot进行鉴定。以重组蛋白为抗原建立酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法,并检测临床收集的梅毒血清。结果成功构建表达载体pET-28b-TP0100,测序结果表明质粒中的插入序列与GenBank中TP0100的基因序列相同。重组蛋白表达约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为23×103。质谱和Western blot分别证实重组蛋白的酶解片段来自于TP0100蛋白,重组蛋白能与梅毒TPPA阳性血清发生特异性反应。ELISA检测20份梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）阳性血清和20份TPPA阴性血清,与TPPA方法的符合率分别为95%（19/20）和100%（20/20）。结论重组硫氧还原蛋白TP0100能够与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,是一个潜在的梅毒血清学诊断抗原。     

梅毒螺旋体嵌合抗原的克隆表达及其临床应用

目的 在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体Tp15—17嵌合抗原,用于临床检测梅毒感染。方法 利用PCR法从Tp全基因组中分别扩增目的基因Tp15和Tp17,用T4DNA连接酶连接后,克隆进表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-6P-1＋Tp15-17,在大肠埃希菌中表达重组Tp嵌合蛋白,重组蛋白经亲和层析柱纯化后包被微孔板,初步建立间接ELISA法检测血清中的抗Tp抗体。结果 重组嵌合抗原获得了高效表达,免疫印迹试验显示重组抗原具有很强的抗原性。用重组嵌合抗原建立间接ELISA法,对梅毒螺旋体抗体阳性参比血清及梅毒患者血清的检测符合率100％。结论 重组梅毒螺旋体嵌合抗原Tpl5—17能够作为梅毒螺旋体诊断性ELISA抗原。     

接触丙烯腈人群中肺炎衣原体感染和血管内皮功能关系的研究

目的；探讨接触丙烯腈人群中，肺炎衣原体（Cpn）感染对人血管内皮功能的影响。方法；以111名从事腈纶纤维生产的工人为研究时象，测定血清一氧化氮代谢产物（NOx）水平、血清总一氧化氮合成酶（tNOS）活力、血清诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）活力，作为评估血管内皮功能的指标。并检测外周血单核细胞（PBMC）中Cpn特异性抗原厦血浆Cpn特异性抗体IgA，IgG及IgM。蛄果：与相应阴性组比较，Cpn抗原阳性组厦Cpn-IgM阳性组NOx水平显著降低（P〈0．05）。以NOx水平为应变量，以Cpn抗原、抗体检出情况、性剐、年龄、家族史、吸烟量、饮酒量、血清甘油三酯等指标为自变量，进行逐步多元线性回归分析。Cpn抗原、Cpn-IgM与血清NOx水平呈显著负相关（P〈O．05）。结论：Cpn感染可损害接触丙烯腈工人的血管内皮功能。     

编码人疱疹病毒8型小衣壳蛋白开放阅读框65的原核表达及应用

目的构建人疱疹病毒8型（HHV8）小衣壳蛋白ORF65编码基因的原核表达载体，并进行原核表达。方法提取BCBL-1细胞（HHV8阳性而EBV阴性）DNA，PCR技术扩增HHV8 ORF65基因，目的基因与原核表达载体pThioHis A连接后，转化宿主菌Escherichia coli BL21，异丙基硫代-D-乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白表达，经带有6个组氨酸标签的亲和层析柱纯化获得重组抗原。重组蛋白电泳后转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，与HHV8阳性血清进行免疫印迹反应。对相关患者进行检测，并与美国Biotrin公司生产的HHV8 IgM和HHV8 IgG抗体间接荧光抗体试验（IFA）检测试剂盒和德国Qiagen公司ELISA检测试剂盒进行比较。结果DNA序列分析表明目的基因序列与HHV8标准毒株相应序列完全一致，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳可观察到相对分子质量为31500的融合蛋白的表达，免疫印迹反应显示重组抗原具有较高的特异性。基因工程抗原的各项技术指标与Biotrin公司和Qiagen公司检测试剂盒有较好的符合率，对临床标本的检测表明该试剂盒简单、实用、结果稳定可靠。结论HHV8重组抗原具有较好的抗原性，进一步完善后可用于HHV8抗体的检测。     

重组泡球蚴主要表面抗原在棘球蚴病免疫诊断中的效果

目的 研究非融合表达重组抗原用于棘球蚴病免疫诊断的效果。方法 将泡球蚴主要表面抗原基因编码序列克隆于原核非融合表达载体pQE30（＋）并进行表达。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）及免疫印迹（WB）试验对重组抗原鉴定。亲和层析纯化重组抗原，用于酶联免疫吸附法（ELISA）检测患者血清特异性抗体。结果 SDS—PAGE及WB分析显示泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌内得到了高效非融合表达。以此重组抗原进行ELISA试验，检测棘球蚴病68例，阳性率达97．1％，检测囊虫等其他感染性疾病80例及健康人血清20份，阴性符合率达98％。结论 泡球蚴主要表面抗原基因在大肠埃希菌中获得了高效非融合表达，以该重组抗原建立的ELISA试验，对棘球蚴病诊断具有较高的敏感性和属特异性。     

HPV 16型L2全长原核融合蛋白的交叉反应特性研究

目的 研究HPV 16型L2全长蛋白在HPV6、11、16和18型别间的交叉反应特性.方法 收集108例尖锐湿疣患者、156例宫颈癌患者和100名健康对照者的血清标本,采用PCR法从宫颈癌患者组织DNA中扩增HPV16 L2全长基因,将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和WB鉴定;进一步通过WB检测HPV16 L2全长融合蛋白与HPV6、11、16和18型DNA检测阳性的患者血清的特异性结合能力.以镍螯合亲和层析柱(Nj-NTA Agarose)纯化HPV16 L2融合蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA法检测3组标本中的HPV血清特异性IgG抗体.结果 成功构建了重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,含有HPV16 L2的融合蛋白在原核表达体系中呈较高效表达,表达量为27.2%;SDS-PAGE和WB检测结果显示在约相对分子质量82 000处可见特异性阳性信号条带;以HPV6、11、16和18 DNA阳性患者血清为一抗的WB结果显示,HPV16 L2全长融合蛋白在相对分子质量82 000处均出现特异性阳性信号条带.ELISA结果显示,尖锐湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清抗体A值分别为0.825±0.409、0.808±0.376、0.128±0.15,阳性率分别为92.6%、92.3%和6.0%.3组间血清抗体A值及阳性率差异均具有统计学意义(H=207.292,x2=251.846,P均＜0.01),而尖锐湿疣组与宫颈癌组之间的血清抗体均值(0.825和0.808)差异无统计学意义(H=0,P＞0.05).结论 HPV16 L2全长原核融合蛋白具有较强的抗原性,与HPV6、11、16和18型别间具有交叉反应,可进一步用于HPV感染及其相关肿瘤ELISA血清学检测试剂的通用型靶抗原研究.     

Expression of recombinant proteins of Orientia tsutsugamushi and their applications in the serodiagnosis of scrub typhus

In this study, recombinant proteins that encompassed the AD I-AD III regions of 56 kDa immunodominant gene of 2 Orientia tsutsugamushi (OT) serotypes; Gilliam and TA763 were expressed in Escherichia coli. Both recombinant proteins exhibited serologic cross-reactivity with the rabbit antisera against various OT serotypes, as evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), but not against other rickettsial species, including Rickettsia typhi, R. prowazekii and TT118 SFG rickettsiae. The feasibility of using the recombinant proteins as a diagnostic reagent was further evaluated by ELISA using sera from blood donors and scrub typhus patients. The results suggested a higher affinity of the antihuman IgM than IgG with both recombinant proteins. The IgM ELISA findings were agreeable with the results of indirect immunoperoxidase (IIP) assay especially with sera of high antibody (1:1600). However, more than one antigen are probably needed for development of an effective assay for serodiagnosis of scrub typhus in endemic areas.     

肺炎衣原体感染与急性心肌梗死的相关性

目的探讨肺炎衣原体(Cpn)感染与冠心病心肌梗死的关系。方法测定51例急性心肌梗死(AMI)和42例陈旧性心肌梗死(OMI)患者及31例冠脉造影正常者(NC)的Cpn抗体(CpnIgG、CpnIgM)水平及DAN,同时观测C反应蛋白(CRP)、血脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)]变化。结果AMI组CpnIgG、CpnIgM阳性率及水平高于NC组(P<0.05),CpnDNA检测结果与之吻合。校正冠心病危险因素前、后,CpnIgG阳性与AMI均有相关关系(OR=3.653,P=0.025;OR=3.174,P=0.033)。AMI组中Cpn(+)组CRP、TC、TG、LDLC高于同组中Cpn(-)组(均P<0.05),且IgG与CRP、TC、LDLC呈正相关(P<0.05),调整与CRP相关的冠心病危险因素后,IgG与CRP仍呈正相关;OMI组中Cpn(+)组TG明显高于Cpn(-)组(P<0.05),IgG与TG呈正相关。结论Cpn感染与AMI之间存在明显的相关性,与血脂、CRP也存在相关性。     

检测丙型肝炎病毒F抗体的一种间接ELISA的初步评价

目的评价以丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）的准确性和可靠性。方法以基因工程重组HCV F抗原包被酶标微孔板,检测HCV感染者血清抗-F滴度,建立阳性判断值,计算HCV感染者血清抗-F阳性率。与某市售HCV ELISA试剂同时检测HCV感染者和非感染者抗-F阳性率,计算该ELISA的敏感性和特异性等技术指标。结果该间接ELISA检测的敏感性为66.7%,特异性为96.7%,正确指数为63.3%,一致率为81.7%,Kappa值为0.63,变异系数（CV）为6.23%。结论该间接ELISA初步评价指标符合准确性和可靠性要求,具有潜在补充检测HCV感染的扩展应用价值。     

自制与进口肺炎衣原体单克隆抗体的特性比较

目的:自制肺炎衣原体单克隆抗体(Cpn-McAb)与进口Cpn-McAb的特性比较及临床应用。方法:双向琼脂扩散法鉴定自制Cpn-McAb的效价和IgG亚型,用显色法检测单抗与Cpn-MOMP的免疫反应,然后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记纯化的IgG。为了评估Cpn-McAb,用自制和进口Cpn-McAb同时检测外周血标本454例。另外,分别从Cpn特异性抗原(Cpn-Ag)阳性的外周血单核细胞(PBMC)标本(A组)中和Cpn-Ag阴性的对照组(B组)中随机各挑选40例,用PCR检测PBMC中的Cpn-DNA。结果:免疫琼脂扩散结果表明,Cpn单抗为IgG2b亚型,扩散效价为1:128。在1:30工作浓度下,微量免疫荧光检测的结果表明,自制Cpn-McAb与鹦鹉热衣原体有较弱的交叉反应;与沙眼衣原体无交叉反应,特性与进口Cpn-McAb一致。自制Cpn-McAb检测PBMC的Cpn-Ag阳性率为53.3%(242/454),进口Cpn-McAb检测PBMC的阳性率为52.6%(239/454),两种单抗检测同时阳性的标本207例,Kappa值是0.704,根据其判断标准提示两者有较高的一致性。A、B两组Cpn-DNA阳性标本分别为38例和2例。结论:自制Cpn-McAb几乎和进口Cpn-McAb一样有较高的特异性和敏感性,有可能替代进口单抗用于临床Cpn感染的检测,有助于相关疾病的诊治。     

人血清IgG类抗LDH-C4抗体的ELISA检测及其意义

目的建立检测人血清IgG类抗精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)抗体的ELISA法,探讨人血清抗LDH-C4抗体与免疫性不育的关系。方法以重组人LDH-C4(rhLDH-C4)作为包被抗原,建立人血清IgG类抗LDH-C4抗体检测的间接ELISA方法。应用该方法检测74例健康人群(正常生育组)和177例不育人群(不育组)血清IgG类抗LDH-C4抗体。结果初步建立了检测人血清IgG类抗LDH-C4抗体的间接ELISA方法。不育组血清IgG类抗LDH-C4抗体阳性率(30.51%)显著高于正常生育组(9.46%)(P0.01),女性不育组阳性率(31.46%)与男性不育组(29.55%)差异不显著(P0.05)。结论人血清中存在着IgG类抗LDH-C4抗体,此类抗体可能与免疫性不育有密切关系。