RNA干扰技术逆转神经胶质瘤细胞多药耐药性

目的 探讨利用RNA干扰（RNAi）技术逆转神经胶质瘤细胞多药耐药性。方法 根据多药耐药基因1（MDR1）的碱基序列设计并合成短发夹RNA（shRNA）,构建逆转录病毒质粒载体,用阳离子脂质体法体外转染BT325细胞株,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达作为对照。采用定量PCR、Northern blot检测转染前后MDR1 mRNA的表达,Western blot检测蛋白表达;使用CCK-8试剂盒对转染后的细胞进行化疗药物敏感性试验,评价RNAi对多药耐药性的逆转作用。结果 成功构建RNAi质粒载体。共转染实验组RT-PCR定量MDR1 mRNA相对表达水平均有所下降（P〈0．05）;Northern blot表明,转染48h细胞干扰最强;Western blot显示,siRNA各转染组P-糖蛋白（P-gp）的表达分别降低12．9％、30．3％和4．8％,在48h抑制最强;而药物敏感试验显示,转染siRNA后细胞对药物的敏感性明显增强。结论 RNAi能够明显抑制神经胶质瘤细胞系MDR1 mRNA和P-gp蛋白的表达,进而对多药耐药性发挥明显的逆转作用,为基因治疗提供了一种新的手段。     

环胞菌素A 逆转数种人类胶质瘤细胞多药耐药性的体外实验研究

 目的　探讨环胞菌素A体外逆转人类胶质瘤细多药耐药性的作用及其机理。方法　采用有MDR1和MRP表达的人类胶质瘤细系 ,通过放射自显影观察应用环胞菌素A前后抗癌药物在细胞内的积累与外排量。结果　在有MDR1和MRP表达的人类胶质瘤细胞系中 ,加入环胞菌素A后细胞内抗癌药物积累量显著增加 (P <0 .0 5 )。结论　环胞菌素A可增加耐药细胞对抗癌药的敏感性 ,在体外能有效地逆转入类胶质瘤细胞的多药耐药性。其作用机制除了与细胞膜上的P -糖蛋白竞争性结合、抑制药物外排 ,对MRP过度表达的胶质瘤细胞系也有逆转作用 ,这可能与细胞类型有关。     

多药耐药性逆转问题研究进展

肿瘤化疗失败的一个重要原因是由于肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性,即肿瘤细胞可耐受结构、功能及杀伤机制各异的多种化疗药物的作用。要使耐药性得以逆转,扰要阻断其产生的各个环节。逆转剂可分为P-糖蛋白功能抑制剂、MDR基因抑制剂,谷胱甘肽(GSH)合成抑制剂、谷胱甘肽转硫酶合成抑制剂及DNA修复抑制剂等。目前逆转剂应用于临床还存在一定问题,在体内要达到逆转效应所需的剂量已远远超出了人体所能耐受的剂量,目前国内外正致力于克服此缺陷的研究。     

肿瘤多药耐药性及其逆转策略

 肿瘤细胞多药耐药性（multidrug resistance，MDR）的产生是导致肿瘤化疗失败的主要原因之一。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的其他抗肿瘤药物产生交叉耐药性的现象。^[1]      

PSC833逆转人骨肉瘤细胞株多药耐药性的研究

目的 探讨PSC 833对骨肉瘤耐药细胞株U2OS/DOX的逆转作用及其机制。方法 用MTT法进行PSC 833逆转MDR活性测定;用流式细胞仪技术，观察PSC833对细胞内Rh123积聚和外排的影响；用免疫荧光技术定量检测逆转剂对P-gp表达水平的影响。结果 PSC833能显著增加DOX对U2OS/DOX的细胞毒性作用，逆转效果明显强于VPL和 CSA，且存在剂量依赖关系,对敏感株U2OS无明显作用；PSC 833能使耐药株细胞内Rh123外排减少、积聚增加，而对P-gp的表达水平没有明显影响。结论 PSC833能增强DOX对U2OS/DOX的细胞毒性作用，逆转MDR效果明显优于VPL和CSA，其机理在于抑制耐药株细胞膜上P-gp的功能，而对P-gp的表达水平没有影响。     

甲基莲心碱对人乳腺癌细胞阿霉素多药耐药性的逆转

目的:研究甲基莲心碱对人乳腺癌细胞阿霉素耐药株MCF7/Adr多药耐药multidrugresistanceMDR性的逆转作用及其机制。方法:采用MTT法检测药物细胞毒性作用,高效液相色谱法检测细胞内阿霉素ADR的浓度,流式细胞术测定细胞P糖蛋白Pgp的表达。结果:甲基莲心碱1～10μmol·L-1能不同程度地降低ADR对MCF7/Adr细胞的IC50。10μmol·L-1甲基莲心碱能显著提高ADR在MCF7/Adr细胞内的浓度,降低MCF7/Adr细胞Pgp的表达。结论:甲基莲心碱能逆转MCF7/Adr细胞的MDR,其机理与抑制Pgp的功能及其表达,增加细胞内ADR的积累有关。     

甲基莲心碱逆转人胃癌细胞株多药耐药性

目的:研究新的钙阻断剂甲基莲心碱(Nef)对耐长春新碱(VCR)人胃癌细胞多药耐药性(MDR)的逆转作用及其机制。方法:采用MTT比色法测定药物的细胞毒作用,SP法免疫细胞化学及流式细胞术检测Nef对人胃癌细胞多药耐药性相关蛋白(MRP)表达的影响。结果:①在10μmol/L的浓度下,Nef对SGC7901及SGC7901/VCR无显著细胞毒作用;②2.5、5、10μmol/LNef能使VCR对SGC7901/VCR细胞的IC50从2.32μg/ml依次下降至0.340、0.128、0.053μg/ml,逆转倍数分别为6.8、18.1、43.8。在浓度为10μmol/L时,逆转活性较VRP为高(P<0.01);③SGC7901/VCR细胞较SGC7901细胞高表达MRP,经Nef处理后,SGC7901/VCR细胞MRP表达明显下降。表明Nef能下调SGC7901/VCR细胞MRP的表达。结论:甲基莲心碱在体外能逆转耐长春新碱人胃癌细胞(SGC7901/VCR)的多药耐药性。其机制可能与下调MRP的表达有关。     

RNA干扰细胞黏附分子L1表达逆转胶质瘤U251细胞多药耐药

背景与目的：细胞黏附分子L1（cell adhesionmoleculeL1,L1CAM）是一种跨膜黏附蛋白,在神经系统发育及肿瘤发生中发挥重要作用。本研究运用RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术抑制L1CAM表达,并探讨其对胶质瘤U251细胞多药耐药的逆转作用及相关分子机制。方法：将针对L1CAM的小干扰RNA（siLl）和阴性对照siRNAfsiCon）转染人胶质瘤U251细胞。实验分3组：空白对照组（胶质瘤U251细胞）、阴性对照组（转染siCon的胶质瘤U251细胞）、实验组f转染siLl的胶质瘤U251细胞）。蛋白质印迹法（Westernblotting）~U251细胞中L1CAM、MRPl、pAKT及pERK1／2等蛋白表达。细胞增殖实验检测L1CAM对顺铂（cisplatin）和P13K／AKT抑制剂LY294002抑制U251细胞增殖的影响。免疫荧光染色法检测抑制LICAM表达对U251细胞系中AKT磷酸化情况的影响。结果：实验组L1CAM、pAKT．pERKl／2蛋白表达量明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0．01）,但实验组多药耐药蛋白MRPl表达量以及Bcl-2cdBax与阴性对照组和空白对照组相比无明显变化。实验组顺铂和LY294002对U251细胞增殖的抑制率高于阴性对照组和空白对照组,提示抑制LICAM表达后细胞对顺铂和LY294002的敏感性增加。免疫荧光结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞内AKT磷酸化信号明显降低。结论：RNAi抑制L1CAM表达能增强顺铂和LY294002对U251细胞增殖的抑制作用,并可抑制P13K／AKT和MAPK信号激活．一定程度上可逆转胶质瘤细胞的多药耐药性。     

食管癌细胞系KYSE150中RNA干扰MTA1的基因芯片分析

目的探讨MTA1对食管癌转移相关基因的影响。方法用RNA干扰的方法在食管癌细胞系KYSE150中沉默MTA1基因的表达,随后进行转移相关基因芯片分析。以两次芯片分析中均上调2倍以上(或下调1/2)为差异显著基因。通过DIVID生物信息学数据库进行gene ontology的通路分析。结果在两次基因芯片分析中均有意义上调的基因共有7个,分别是LAMC1、MMP14、MMP15、MDM2、API5、ODC1、PTGS2;而两次均显著下调的基因共有14个,它们是CSF1R、HGF、IGF2、ITGA6、MMP9、MMP11、MMP13、CASP8、CTSD、TMPRSS4、THBS2、TIMP1、ENPP2、SNCG。通过在DAVID生物信息学数据库中对上述表达差异显著的基因进行通路分析,结果提示差异基因主要富集在5条信号通路上,分别是肿瘤信号通路(MDM2、CASP8、CSF1R、HGF、ITGA6、LAMC1、MMP9、PTGS2)、ECM受体整合信号通路(LAMC1、THBS、ITGA6)、基质金属蛋白酶信号通路(TIMP1、MMP9)、小细胞肺癌信号通路(ITGA6、Cox2)和黏着斑信号通路(ITGA6、HGF、IGF2)。结论 MTA1参与了转移相关的一系列分子改变事件,尚需进一步的分子生物学方法验证这些基因调控的信号途径。     

人脑胶质瘤组织高表达nNav1.5促进肿瘤细胞的迁移和侵袭

目的：观察电压-门控钠离子通道（voltage-gated sodium channel, VGSC）亚型nNav1.5在人脑胶质瘤组织中的表达,并探讨其对脑胶质瘤U251细胞迁移及侵袭的影响。方法：收集中国医科大学附属第一医院神经外科于2011年10月至2012年10月手术切除并经病理证实的脑胶质瘤组织标本68例,应用免疫组织化学S-P法检测脑胶质瘤组织中nNav1.5的表达。设计并化学合成nNav1.5基因特异性小干扰RNA（nNav1.5-siRNA）,用脂质体介导转染胶质瘤U251细胞,应用Real-time PCR和Western blotting法分别检测U251细胞中nNav1.5 mRNA和蛋白的表达水平,并采用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测U251细胞迁移和侵袭能力的变化。结果：nNav1.5在人脑胶质瘤组织中表达的阳性率显著高于正常组织（72.6% vs 23.0%,P<0.01）,并且其在高级别胶质瘤（WHO Ⅲ～Ⅳ级）组织中的阳性率明显高于低级别胶质瘤（WHOⅠ～Ⅱ级）组织（85.8% vs 52.9%,P<0.01）。nNav1.5-siRNA转染可显著抑制U251细胞中nNav1.5 mRNA和蛋白的表达（P<0.01）;转染后U251细胞的迁移距离明显小于未转染细胞\[(0.019±0.015) vs（0.223±0.031）mm,P<0.01\],且其侵袭指数明显低于未转染细胞\[(2.99±0.15)% vs（6.77±0.26）%,P<0.01\]。〖JP2〗结论：nNav1.5在人脑胶质瘤组织中高表达,干扰nNav1.5表达可显著抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力,nNav1.5是胶质瘤恶性侵袭的调控因子并有望成为胶质瘤的新标志物和治疗靶点。     

人脑胶质瘤高表达Snail促进肿瘤细胞的侵袭

目的:观察Snail蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达情况,探讨Snail表达对人脑胶质瘤U251细胞侵袭的影响。方法:收集首都医科大学附属北京天坛医院及北京安贞医院神经外科手术切除的脑胶质瘤组织65例,应用免疫组织化学S-P法检测人脑胶质瘤组织中Snail的表达。体外化学合成Snail序列特异性小干扰RNA(Snail-siRNA),应用脂质体介导转染U251细胞;RT-PCR、Western blotting检测转染后U251细胞中Snail mRNA和蛋白、E-cadherin蛋白表达水平变化,并采用Transwell小室检测转染后U251细胞侵袭能力的变化。结果:与正常脑组织相比,人脑胶质瘤组织中Snail蛋白阳性表达率明显增强(66.2%vs0,P<0.01),并且Ⅰ～Ⅱ级的胶质瘤组织阳性Snail阳性率明显低于Ⅲ～Ⅳ级(44.8%vs83.3%,P<0.01)。Snail-siRNA转染抑制U251细胞中Snail mRNA和蛋白的表达。Snail-siRNA转染组U251细胞中E-cadherin蛋白的表达明显高于Ctrl-siRNA组与未转染组(0.64±0.21vs0.15±0.16,0.21±0.19,P<0.01)。Snail-siRNA转染显著抑制U251细胞的侵袭(87.0±2.4vs140.0±4.9,136.0±5.3;P<0.05)。结论:人脑胶质瘤组织高表达Snail蛋白,siRNA干扰Snail蛋白的表达可抑制胶质瘤U251细胞的侵袭。     

靶向survivin的siRNA对骨肉瘤细胞MG63的抑制作用

目的：探讨针对人survivin基因的siRNA对骨肉瘤细胞MG63的体内外抑制作用。方法：合成survivin基因的RNA干涉（RNA interferance,RNAi）特异性片段,构建survivin特异性的RNA干涉载体pSiS,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。细胞计数检测细胞生长情况;Western blotting检测细胞中survivin蛋白表达的变化;通过Annexin V法染色和流式细胞术检测细胞凋亡;观察裸鼠皮下MG63移植瘤的形成。结果：成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体pSiS,获得了稳定转染的细胞MG63/pSiS。与MG63、MG63/pSi（空质粒对照细胞）相比,MG63/pSiS细胞生长曲线十分平缓,差异有统计学意义（P〈0.01）;Western blotting显示,MG63/pSiS细胞中survivin蛋白表达减少,细胞凋亡率增加（P〈0.01）。MG63/pSiS移植瘤形成明显受到抑制。结论：Survivin特异性siRNA可明显促进骨肉瘤细胞MG63的凋亡,抑制该肿瘤细胞体外生长和体内移植成瘤。     

RNA干扰技术对裸鼠人胶质瘤放射增敏及其机制的探讨

目的:探讨RNA干扰(RNAi)联合放射对裸鼠移植瘤的作用及其机制。方法:设计靶向hTERT基因的小干扰RNA(siRNA),构建重组质粒hTERT-pGenesil并转染U251细胞,将其种植于裸鼠从而建立裸鼠移植瘤模型。在RNA干扰时联合2Gyγ射线照射,采用TRAP-PCR-ELISA法和彗星电泳分析方法同时检测对照组、RNAi治疗组、放射治疗组及RNAi联合放射治疗组的端粒酶活性和DNA单链断裂(尾矩)。结果:对照组与RNAi治疗组细胞无彗尾(P=0.796),表明RNAi本身不会导致DNA单链断裂(SSB);而放射治疗组和RNAi联合放射治疗组均出现明显的彗星图像,且RNAi联合放射治疗组的彗尾较放射治疗组显著,P<0.05。对照组、RNAi治疗组、放射治疗组及RNAi联合放射治疗组的端粒酶活性(A值)分别1.182±0.019、0.578±0.034、1.394±0.027和0.871±0.031,显示siRNA有减少端粒酶活性的作用(P<0.05),而2Gy放疗使端粒酶活性有所升高,P<0.05。结论:通过RNA干扰技术抑制裸鼠人胶质瘤hTERT基因的表达,降低端粒酶活性,减少DNA损伤的修复,...     

肝癌细胞系BEL-7402中siRNA表达载体介导靶向c-myc基因的RNA干涉实验研究

Objective： To explore the inhibition of the expression of c-Myc in human hepatocellular carcinoma via vector-based RNA interference （RNAi）. Methods： Two RNA interference DNA templates targeting c-Myc oncogene were designed via online software and synthesized. By ligation, the fragments were inserted into pSilencer 1.0-U6 to construct the recombinant siRNA expressing plasmids. The identified recombinants were introduced into BEL-7402 cells with Lipofactamine. The inhibition of c-Myc expression, together with the expression of CDK4, hTERT and Gadd45β in c-Myc down-regulated BEL-7402 cells, were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Two recombinant plasmids pSic-myc-1 and pSic-myc-2, which direct the yields of siRNAs targeting c-Myc in cells, were constructed. Among which, pSic-myc-2 was shown to trigger a RNAi-mediated inhibition of expression of c-Myc in BEL-7402 by up to 90%. In c-Myc knockdown BEL-7402 cells, the expression of CDK4 and hTERT were down-regulated with a ratio of 85% and 57%, respectively, while the expression of Gadd45β was up-regulated by up to 110%. Conclusion： The expression of c-Myc in BEL-7402 could be suppressed by vector-based RNA interference successfully. The knockdown of c-Myc in turn resulted in the changes of expression of genes related to cell proliferation and apoptosis. Thus, our study provided a preliminary data in searching of a c-Myc-targeted RNAi therapy of human hepatocellular carcinoma.     

沉默Bcl-XL逆转人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药

目的:探讨RNA干扰Bcl-XL(siRNA）在人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药中的作用。方法:以Bcl-XL siRNA转染获得性SLC22A18耐药的人胶质瘤U251-SLC22A18/R细胞,用重组人SLC22A18蛋白处理,MTT法和流式细胞仪检测肿瘤细胞的存活率,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8的表达情况。结果:Bcl-XL siRNA能够降低U251-SLC22A18/R细胞中Bcl-XL的表达,也能逆转其对SLC22A18的耐药。U251-SLC22A18/R细胞经过Bcl-XL siRNA和重组人SLC22A18蛋白共同处理4 h后细胞凋亡率>50%,细胞存活率<30%;而对照组和重组人SLC22A18蛋白处理组的细胞凋亡率和存活率无明显变化。经Bcl-XL siRNA与重组人SLC22A18蛋白联合处理后,U251-SLC22A18/R细胞中Caspase-3和Caspase-8均明显活化。结论:Bcl-XL siRNA能有效逆转人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药,为治疗胶质瘤耐药提供一种新的思路。     

RNAi沉默Cyr61基因对喉癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的：观察RNA干扰技术沉默Cyr61基因表达对人喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响。方法：针对Cyr61mRNA的序列设计合成小于扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT—Cyr61重组质粒,转染人喉癌Hep-2细胞;RT—PCR和Westernblot检测其对Hep-2细胞内源性Cyr61表达的影响;四甲基偶氮唑蓝（MTr）法观察Hep-2细胞体外增殖活性变化;Transwell小室法检测Hep-2细胞体外侵袭能力的改变;流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡。结果：pRNAT—Cyr61重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制Cyr61基因表达,抑制率分别最高达到74．62％和78．43％;Hep-2细胞的体外生长抑制率最高达68．22％,侵袭细胞数下降至（44．00±2．35）个;Hep-2细胞凋亡率最高达52．98％。结论：pRNAT—Cyr61可抑制Cyr61在喉癌Hep-2细胞中的表达,并抑制细胞的增殖活性和侵袭能力,促进细胞凋亡。     

人脑胶质瘤高表达nNav1.5促进肿瘤细胞侵袭

目的：观察电压-门控钠离子通道（VGSCs）亚型nNav1.5在人脑胶质瘤组织中的表达,探讨nNav1.5表达对胶质瘤U251细胞迁移及侵袭的影响。方法：收集本科室手术切除的脑胶质瘤标本68例,应用免疫组织化学S-P法检测胶质瘤组织中nNav1.5的表达。设计合成nNav1.5特异性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,用脂质体转染至U251细胞,应用Real-time RT-PCR和Western blot法分别检测nNav1.5的mRNA和蛋白表达水平的变化,应用划痕实验和Matrigel侵袭实验检测U251细胞迁移和侵袭能力。结果：与正常组织相比,nNav1.5在胶质瘤组织中表达率明显升高（72.6% vs 23.0%,P < 0.01）,并且其在低级别胶质瘤中（WHOⅠ～Ⅱ级）明显高于其在高级别胶质瘤（WHO Ⅲ～Ⅳ级）中的表达率（52.9% vs 85.8%,P < 0.01）;siRNA显著抑制U251细胞中nNav1.5的mRNA和蛋白表达并明显降低U251细胞的迁移侵袭能力。结论：电压-门控钠离子通道nNav1.5在胶质瘤中高表达并促进U251细胞的迁移和侵袭能力,nNav1.5是胶质瘤恶性侵袭的调控因子,有望成为胶质瘤的新标记物和治疗靶点。     

siRNA沉默livin的表达对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)沉默人结肠癌HT-29细胞livin表达对HT-29细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:合成靶向livin的双链siRNA(livin-siRNA),转染HT-29细胞,RT-PCR及Western blotting检测HT-29细胞中livin mRNA及蛋白的表达,MTT实验检测HT-29细胞的增殖,流式细胞术检测HT-29细胞周期分布及凋亡,细胞侵袭实验检测HT-29细胞侵袭性的变化,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性的变化。结果:Livin-siRNA转染后48 h,与空白组、阴性对照组及脂质体组相比,livin-siRNA转染组HT-29细胞中livin mRNA水平明显下降(0.073±0.007 vs 0.395±0.082、0.423±0.025、0.418±0.032,P<0.05),其蛋白表达也明显下调(0.106±0.003 vs 0.456±0.065、0.473±0.078、0.491±0.045,P<0.05)。转染96 h后,livin-siRNA组HT-29细胞增殖能力明显低于对照组及脂质体组(0.564±0.102 vs0.833±0.127、0.860±0.153,P<0.05),且细胞凋亡率升高[(16.5±2.8)%vs(2.4±0.5)%、(3.7±1.0)%,P<0.05]。侵袭实验显示,livin-siRNA转染后,穿过Matrigel膜的HT-29细胞数量明显少于对照组及脂质体组[(31.3±4.5)vs(101.3±8.6)、(97.4±7.8)个,P<0.05)]。livin-siRNA组HT-29细胞的caspase-3活性低于对照组(0.160±0.023 vs 0.347±0.058,P<0.05)。结论:siRNA沉默livin的表达可抑制HT-29细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制细胞的侵袭。