小鼠肺移植慢性排斥反应模型移植气道中基因差异表达研究

目的 应用基因芯片技术分析肺移植后闭塞性细支气管炎(OB)形成前期移植气道的基因表达谱.方法 首先建立小鼠异位气道移植OB模型,BALB/c小鼠气道异位移植到C57BL/6小鼠(同种异体移植组)或(同系移植组)背部皮下.分别在术后5、15和25d取出移植气道检测形态学改变,并利用CSME-80鼠cDNA芯片检测15 d时两组移植物内基因表达差异,分析具有统计学意义的基因表达和OB发病的关系.结果 OB前期存在大量基因表达变化,在2个通道均为有效的杂交信号中,上调表达的有422个,主要涉与细胞生存相关的基因类型.结论 肺移植后OB是多因素参与的不平衡过程.大量基因与细胞生存相关,免疫性因素相对较少,提示可能的肺移植OB治疗策略的转变.     

巨噬细胞极化介导闭塞性细支气管炎发生的机制研究

目的研究巨噬细胞的极化状态及IL-17在OB发生中的作用。方法采用小鼠同种异体原位气管移植模型模拟闭塞性细支气管炎的病理改变。20~25 g清洁级C57BL/6,雄性,20只;IL-17基因敲除C57BL/6,雄性,10只;BALB/c雄性,10只,按体质量随机配对分为三组。正常C57BL/6（n=10）无手术对照组;实验组A：BALB/c（n=5）→C57BL/6（n=10）组;实验组B：BALB/c（n=5）→IL-17基因敲除C57BL/6（n=10）组。分别于术后第14、30天取出移植气管进行病理形态学检测。于术后第7、14、30天检测脾脏中巨噬细胞M1型巨噬细胞的标记CD86的表达水平。结果与对照组相比,接受气管移植的野生型小鼠中,M1型巨噬细胞的标记CD86随移植后时间的延长,逐渐下调;IL-17基因敲除受体组巨噬细胞表面CD86的表达水平与对照组相比,明显下调。BALB/c→C57BL/6组较对照组管腔明显狭窄,BALB/c→IL-17基因敲除组较BALB/c→C57BL/6组管腔狭窄明显减轻。结论巨噬细胞向M1方向极化与OB发生的病理过程密切相关,IL-17基因敲除明显下调小鼠气管移植模型体内巨噬细胞表面CD86的表达水平,并减轻气管移植物的病理改变。     

模拟肺移植后闭塞性细支气管炎小鼠模型的建立

目的 为了更好地研究肺移植术后闭塞性细支气管炎( obliterative bronchiolitis,OB)的发病机制和预防治疗策略,建立一种稳定的小鼠闭塞性细支气管炎模型的方法.方法 20～ 25 g清洁级的C57BL/6,雄性,25只;BALB/c雄性,5只,按体质量配对分为两组,实验组A:BALB/c(n=5)→C57BL/6(n=10);对照组B:C57BL/6(n =5)→C57BL/6(n=10),进行气管原位移植.使用H-E染色,对比观察同种异体气管移植、同系气管移植和未进行气管移植小鼠闭塞性细支气管炎的发生情况.结果 小鼠模型建立过程中病死率0％ (0/20),术后4周病死率5％(1/20).病理显示实验组小鼠气管内皮受损,黏膜下层有大量炎症细浸润,纤维组织增生,模型闭塞性细支气管炎的发生率为100％.而对照组均未发生OB,移植气管形态接近正常,无管腔狭窄.结论 本研究成功地建立了模拟肺移植术后闭塞性细支气管炎的小鼠原位气管模型,为研究闭塞性细支气管炎的发病机制和预防治疗策略奠定了基础.     

同种异体近交系小鼠原位气管移植模型的建立

目的:建立近交系小鼠同种异体原位气管移植模型.方法:供受体体质量配对后,C57BL/6 和BALB/c小鼠随机分为2组,每组各10对,A组为C57BL/6(供体) → BALB/c(受体)组,B组BALB/c(供体) →BALB/c(受体)组,昆明种小鼠10对作为C组即KM(供体) →KM(受体)组. 利用颈前肌肉及周围组织被覆移植气管提供血供建立同种异体小鼠原位气管移植模型. 使用HE染色以及扫描电镜对同种异体小鼠原位气管移植模型进行评估,观察比较上皮积分、淋巴细胞计数以及无核软骨细胞/全部软骨细胞等指标.结果:A, B组全部存活,C组存活6只. A, C组移植气管均发生一定程度的排斥反应,B组无排斥反应发生. A, B, C三组上皮积分分别为: 1.094±0.120分,2.872±0.059分及0.995±0.444分;无核软骨细胞数/骨细胞总数比值分别为:(27.22±1.09)%, (10.60±1.01)% 及(31.40±6.43)%;淋巴细胞计数分别(20.18±1.31)个/HPF,≤5个/HPF及(22.55±4.87)个/HPF. A, B组及C,B组各项指标相比均有统计学意义,而A,C组相比则差异无统计学意义;且C组各数值离散程度均大于A组.结论:成功建立了C57BL/6(供体) → BALB/c(受体)小鼠原位气管移植模型. 近交系及封闭群模型均能反应移植气管的各种病理生理变化,但封闭群模型稳定性较近交系差.     

阻断CD40-CD40L信号通路对小鼠肺移植术后闭塞性细支气管炎的影响

目的 本研究使用抗CD40L抗体（克隆号：MR1）阻断CD40-CD40L信号通路,利用小鼠原位左肺移植模型,对比其与传统免疫抑制剂环孢素/甲泼尼龙对小鼠术后移植物闭塞性细支气管炎（obliterative bronchiolitis,OB）的治疗效果,并进一步评估其对移植物术后损伤的影响及相应机制,为临床肺移植术后治疗方法提供新思路。方法 构建小鼠原位左肺移植模型,以野生型Balb/c小鼠作为供体小鼠,野生型C57BL/6小鼠作为受体小鼠。移植术后10 d,牺牲小鼠,采用苏木精/伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色、Masson染色以及中性粒细胞特异性染色（抗髓过氧化物酶）,观察各组移植左肺的组织病理学改变,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测移植物中白细胞介素-17A（interleukin-17A,IL-17A） mRNA的表达水平的变化。结果 术后10 d,注射了环孢素/甲泼尼龙和抗CD40L抗体治疗的小鼠,移植左肺外观体积增大;病理结果显示抗CD40L抗体治疗组较环孢素/甲泼尼龙治疗组炎性细胞浸润和OB现象得到有效缓解（P<0.05）,中性粒细胞浸润显著减少（P<0.01）;抗CD40L抗体治疗组移植物中IL-17A mRNA表达水平,较环孢素/甲泼尼龙治疗组显著降低（P<0.01）。结论 利用抗CD40L抗体阻断CD40-CD40L信号通路能够有效保护移植物细支气管上皮,缓解小鼠肺移植术后急性排斥和OB反应以及小气道损伤,且效果优于传统抑制剂环孢素/甲泼尼龙。     

大鼠肺移植受体OB与细胞凋亡关系的初步研究

目的探讨大鼠肺移植受体闭塞性细支气管炎(OB)与细胞凋亡的关系。方法采用大鼠气管异位移植模型模拟肺移植术后OB。随机分为对照组、移植组和免疫抑制剂治疗组,分别于术后7、14和28?d取出移植物。原位末端标记法（TUNEL）检测移植气管细胞凋亡情况;免疫组织化学EnVison法检测移植气管Caspase 3和Bax基因蛋白的表达。结果① 动物模型气管HE染色检测到术后排斥反应,与OB组织学改变符合;② TUNEL检测到大鼠OB模型存在细胞凋亡,免疫抑制剂治疗组较移植组细胞凋亡数少,移植中后期两组差异有统计学意义（P＜0.05）;③ 免疫组织化学检测到大鼠OB模型Caspase 3、Bax基因蛋白表达在移植组和免疫抑制剂治疗组增高,移植中后期两组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论① 大鼠肺移植受体OB与细胞凋亡相关;② 抑制细胞凋亡可治疗肺移植受体OB。     

免疫抑制治疗对受体上皮细胞灌注后大鼠气管异位移植再上皮化影响

目的探讨免疫抑制治疗对受体源性的再上皮化过程的影响,以及免疫抑制治疗的最佳方案。方法将60只大鼠随机分为6组,每组10只,建立大鼠气管异位移植模型。对照组1:大鼠气管内注入生理盐水;对照组2:大鼠气管内注入受体上皮细胞悬液;实验组1:大鼠气管内注入受体上皮细胞悬液,移植后每日肌肉注射他克莫司(FK506)0.5mg/kg,共3d;实验组2:大鼠气管内灌注受体上皮细胞悬液,移植后每日肌肉注射FK506 0.5mg/kg,共10d;实验组3:气管内灌注受体上皮细胞悬液,移植后每日肌肉注射FK506 1.0mg/kg,共3d;实验组4:气管内灌注受体上皮细胞悬液,移植后每日肌肉注射FK506 1.0mg/kg,共10d。移植后第28天,处死大鼠,取气管制备标本,分别行苏木精-伊红(HE)染色、淋巴细胞浸润计数,上皮细胞CK14、CK18和CFTR分化鉴定,以及透射电镜观察,观察各组大鼠气管异位移植再上皮化的情况。结果对照组1未见任何上皮细胞再生,管腔出现严重狭窄、闭塞;对照组2也未实现再上皮化,但管腔狭窄、闭塞程度稍好于对照组1;实验组1和实验组2气管内壁仅局部有上皮细胞再生,且细胞尚未分化成熟;实验组3和实验组4受体源性再上皮化取得成功,气管内覆盖了完整连续的成熟的纤毛柱状上皮细胞,并具有腺体分泌功能、屏障防御功能。结论气管内注入受体上皮细胞后再实施异位移植,在一定的条件下可实现受体源性的完全再上皮化。     

大鼠气管原位移植建立闭塞性细支气管炎模型

目的 建立大鼠同种异体原位气管移植模拟肺移植后发生的闭塞性细支气管炎(obliterative bronchiolitis,OB)的病变过程,为研究OB提供动物模型.方法 选用近交系Brown Norway(BN)和Lewis大鼠进行原位气管移植,同系移植组:Lewis(供体)→Lewis(受体),18只;异系移植组:BN(供体)→Lewis(受体),18只.于移植后7、14、30、60 d通过Micro-CT扫描观察移植气管影像学变化,并评价阻塞情况;7、30、60 d取出移植气管,HE染色观察移植物的组织病理变化.结果 各时间点,同系移植组移植气管内膜均无明显增厚,炎症细胞浸润少,气道阻塞率在8%左右;异系移植组移植气管内膜明显增厚,早期有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润,晚期主要是淋巴细胞浸润伴纤维组织增生,气道明显狭窄、阻塞,其中以第7天阻塞最重,随后渐改善,7、14、30、60 d气道阻塞率分别为(56.8±9.04)%、(51.05±9.79)%、(44.01±7.92)%和(42.97±8.82)%,各时间点异系移植组和同系移植组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 原位气管移植能够稳定形成可模拟肺移植后OB的气道阻塞性病变,克服了肺移植和异位气管移植用于OB研究的一些限制,可更好地作为OB的动物模型应用于实验研究中.     

小鼠左肺原位移植模型的建立

目的：通过显微外科技术建立小鼠原位肺移植模型,为肺移植研究提供动物模型。方法：采用C57BL/6小鼠作为供、受体,行同基因小鼠原位左肺移植,使用Cuff套管法进行气管及血管吻合。术后7天、14天、21天、28天取移植肺及原肺,行HE染色,评价肺移植后效果。结果：学习曲线后, 共30例小鼠移植,手术成功率89%, 小鼠成活率100%。供体手术时间：35.2?.81min,受体手术时间：24.6?.42min,冷缺血时间是：46.6?.92min,热缺血时间是：17.2?.08min。同基因移植物大体及病理无明显改变,病理显示与原肺无差别。结论：本技术能够方便快捷建立小鼠肺移植模型,成功率高,可重复性强,符合原位肺移植临床生理,是研究肺移植发病机制和治疗的良好动物模型。     

异基因骨髓间充质干细胞逆向嵌合体诱导小鼠皮肤移植耐受研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导移植免疫耐受的可行性,建立小鼠异种逆向嵌合皮肤移植模型.方法 以GFP-C57BL/10雄鼠为BMSCs供者,选择免疫缺陷型BALB/C-nu/nu雌鼠为BMSCs受者,移植BMSCs,建立骨髓嵌合模型;通过RT-PCR检测Y染色体性别决定区基因(SRY)、免疫组化检测GFP蛋白表达量,确定嵌合产生的最佳时间.实验共分3组:将接受BMSCs移植一定时间后的BALB/C-nu/nu雌鼠的皮肤移植给C57BL/10雄鼠(实验组),将未接受BMSCs移植的BALB/C-nu/nu雌鼠的皮肤移植给C57BL/10雄鼠(排斥组),C57BL/10小鼠间进行同种异体皮肤移植(对照组).观察移植皮肤存活情况,检测存活皮肤的血管形成情况,以此探讨逆向嵌合皮肤移植的可行性.结果 成功建立骨髓嵌合模型,用1×106 BMSCs移植后4周,SRY基因和GFP蛋白的表达量最高,分别为1.22±0.10、458.0±3.4,与移植后1周、2周和6周比较差异均有统计学意义(P＜0.05),说明嵌合产生的最佳时间为移植后4周.实验组小鼠供者来源皮肤移植物存活＞14 d,排斥组平均为5d.结论 BMSCs移植后可形成嵌合体,并可逆向嵌合移植诱导异种小鼠皮肤移植耐受.