pCMV －Myc －MyD88重组质粒构建及其在293 T细胞中的表达

目的：构建髓样分化因子88（MyD88）真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为进一步研究应用奠定实验基础。方法从大鼠肝星状细胞株T－6中提取总RNA,应用PCR技术扩增MyD88基因编码序列片段,克隆入真核表达载体pCMV－Myc质粒中,对重组质粒经酶切和测序鉴定后,以钙离子转染法转染至293T细胞中,采用Western blot的方法检测MyD88蛋白的表达,以观察转染及表达效果。结果酶切及测序结果证明pCMV－Myc－MyD88重组质粒的DNA序列正确,将其转染至293T细胞后,MyD88蛋白表达明显增加。结论pCMV－Myc－MyD88重组质粒构建成功,并能在293T细胞中表达,为进一步研究针对MyD88分子的疾病治疗及其生物学功能奠定了实验基础。     

带核定位信号的RARα与JTV1蛋白相互作用的验证实验

目的 通过实验验证带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)与JTV1蛋白之间的相互作用.方法 将表达NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白的两种重组表达质粒共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术在体外验证二者之间的相互作用.结果 NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行免疫印迹检测,可以检测到Myc-JTV1蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术验证了NLS-RARα与JTV1间存在相互作用.     

利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用

目的 利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypothetical protein,HT036)和P311间的相互作用.方法 构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用.结果 构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到HA-HT036的表达.结论 成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用.     

免疫共沉淀检测人p65和SMRT蛋白间相互作用

目的 使用免疫共沉淀技术法检测人p65和SMRT蛋白在儿童急性髓细胞白血病（AML）细胞株THP-1中相互作用。方法 体外人工合成p65基因CDS区碱基序列和SMRT-C 645bp对应的基因片段,分别克隆至pUC57载体,经酶切、测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至带有HA标签和Myc标签的真核表达载体pCMV-HA和pCMV-Myc,测序、酶切鉴定正确后,共转染THP-1细胞,免疫共沉淀法检测二者间相互作用。结果 成功构建了人p65和SMRT蛋白真核表达载体pCMV-HA-p65和pCMV-Myc-SMRT,共转染THP 1细胞,抗HA和Myc多克隆抗体分别沉淀细胞裂解液,用抗Myc和HA单克隆抗体分别进行Western Blotting检测,可以检测到HA-p65和Myc-SMRT蛋白的表达。结论 成功构建了人p65和SMRT蛋白重组真核表达载体,在THP-1细胞株中表达后,免疫共沉淀证实p65和SMRT蛋白间存在相互作用,为进一步探讨儿童AML发病机制和白血病的靶向治疗提供理论依据。     

人肠三叶因子真核载体的构建与表达

目的 构建人肠三叶因子(hITF/hTFF3)的真核载体并在真核细胞中表达.方法 从人结肠粘膜提取总RNA,逆转录多聚酶反应制备总cDNA,PCR扩增hTFF3基因,TA克隆至pGEMT载体中,测序鉴定后将hTFF3基因重组到真核表达载体pCMV5-myc中,转染真核细胞293-T,裂解细胞后分别采用鼠抗人c-myc抗体和鼠抗人11下3抗体行Western-blot了解hTFF3表达情况.结果 从人结肠粘膜成功克隆了hTFF3基因并经测序验证,构建了pCMV5-myc-hTFF3真核表达载体,转染细胞后行western-blot提示hTFF3可在293-T细胞中表达.结论 成功构建pCMV5-myc-hTFF3重组真核载体并在293-T细胞中表达hTFF3蛋白,为进一步研究hTFF3的功能、作用机制及相互作用蛋白奠定了基础.     

带核定位信号的维甲酸受体α 与Ubiquilin 1蛋白相互作用的验证

目的：验证带有核定位信号的维甲酸受体α（nuclear localization signal-retinoic acid receptor α, NLS-RARα）与Ubiquilin 1（UBQLN1）蛋白之间的相互作用。方法：将表达NLS-RARα诱饵蛋白和UBQLN1靶蛋白的两种重组表达质粒pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建真核细胞表达载体pCMV-HA-NLS-RARα 和pCMV-Myc-UBQLN1,经酶切鉴定后,共转染HEK293细胞,利用抗HA多克隆抗体沉淀,抗Myc单克隆抗体检测验证他们之间的相互作用。结果：pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;构建的重组表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-UBQLN1经酶切鉴定成功,转染HEK293细胞后,用免疫共沉淀技术检测到Myc-UBQLN1蛋白的表达。结论：酵母双杂交和免疫共沉淀技术可验证NLS-RARα与UBQLN1之间存在相互作用。     

带核定位信号的RARα与谷氨酸氨连接酶蛋白相互作用的胞内外验证

目的通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用。方法将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活细胞内的相互作用;通过构建GLUL及NLS-RARα蛋白标签融合表达载体,共转染至人胚肾HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术在细胞外验证它们之间的相互作用。结果 GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色的阳性克隆;GLUL蛋白及NLS-RARα标签融合表达载体构建成功,共同转染至HEK293细胞,采用抗HA多克隆抗体免疫沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,抗c-Myc单克隆抗体免疫印迹检测,检测到GLUL-cMyc蛋白。结论采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术成功地在胞内外验证了GLUL与NLS-RARα之间存在特异性的相互作用。     

FTH1真核表达载体的构建与鉴定

目的构建携带人铁蛋白重链多肽1（FTH1）基因的真核表达载体pCMV－Myc-FTH1,为研究FXR1P与FTH1体内相互作用奠定基础。方法以人胎脑cDNA文库为模板进行聚合酶链反应（PCR）特异扩增FrH1基因片段,将扩增片段经EcoRI和XhoI双酶切后克隆到同样经EcoRI和XhoI双酶切的pCMV－Myc载体,酶切鉴定阳性克隆并进一步测序鉴定。结果成功构建了pCMV－Myc—FTH1重组真核表达载体。结论pCMV－Myc—FFH1重组真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1P与VrH1相互作用奠定了基础。对研究FXR1在脆性x综合征中的作用机理提供了依据。     

甲型流感病毒血凝素基因HA和HA1真核载体的构建及其表达研究

目的构建甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）血凝素基因HA和HA1真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法利用RT-PCR技术克隆流感病毒株血凝素HA和HA1基因片段并插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。经酶切、PCR和测序鉴定后用PolyFect脂质体转入HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其瞬时表达。结果血凝素基因HA和HA1的真核表达载体构建成功。转染后免疫荧光技术检测显示两者皆可在HEK293细胞中正确表达。结论成功构建的流感病毒HA和HA1真核表达载体为深入研究病毒的作用机制及核酸疫苗的研究莫定了基础。     

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。     

BPHL与PML-C间相互作用的胞内、外验证

目的 通过酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术验证人联苯样水解酶(BPHL)与缺失核定位信号的人急性早幼粒细胞白血病(PML)基因的coiled-coil的结构域(PML-C)蛋白之间的相互作用。 方法 将表达PML-C诱饵蛋白及BPHL靶蛋白的重组质粒pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交实验验证两者在活细胞内的相互作用。构建能在人胚肾293细胞中表达带HA标签的PML-C融合蛋白的重组载体pCMV-HA-PML-C,经酶切鉴定正确后,和表达带myc标签的BPHL融合蛋白的重组真核表达载体pCMV-myc-BPHL,共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证BPHL与PML-C间的相互作用。 结果 pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆。构建的重组表达载体pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL经双酶切鉴定正确后共转染HEK293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-PML-C相互作用蛋白复合物后,用抗c-myc单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到myc-BPHL的表达蛋白。 结论 成功构建了pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL融合蛋白真核表达重组载体,利用酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术证实BPHL与PML-C之间存在着相互作用。     

Decorin基因过表达对HEK293T细胞微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响

目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)重组质粒,研究其对微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响.方法:从人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)提取总RNA,经RT-PCR获得decorin的全长cDNA,克隆至T-载体pUM-T并测序,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,再次测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,利用RT-PCR、Western Blot方法检测空载体组和重组质粒转染组微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1转录水平及翻译水平的表达.结果:经DNA测序证实人DCN cDNA片段正确插入真核表达载体中.Western Blot结果显示经磷酸钙共沉淀法转染的HEK 293T细胞中目的基因高表达.RT-PCR和Western Blot结果显示,与空载体组相比,重组质粒转染组LC3转录水平显著降低,beclin1和LC3-Ⅱ的翻译水平均显著降低.结论:成功构建人DCN重组质粒,其在HEK 293T中过表达可以显著降低微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达,为进一步研究DCN与自噬的相互作用奠定了基础.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

人p65和IκBα基因真核表达载体的构建及在永生化滑膜细胞中的表达

目的：构建人p65和IκBα基因的真核表达载体并检测其在人永生化滑膜细胞MH7a中的毒达．方法：应用RT—PCR方法从体外培养的HEK293细胞mRNA中扩增出p65和IκBα基因的编码区。克隆至pMD18T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1myc／His（-）A,酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染MH7a细胞,Western Blot检测p65和IκBα的表达．结果：测序证实PCR扩增得到的p65和IκBα基因编码区序列正确;脂质体法转染MH7a细胞后检测到预期目的蛋白的表达．结论：成功构建了p65和IκBα的真核表达载体并使其在人永生化滑膜细胞中表达．     

人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达

目的构建含有标签蛋白的人环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)的真核表达载体,并观测其在293T细胞中的表达。方法使用MEGA5.0等生物学软件构建人RNF11的分子进化树;应用RT-PCR从4种人胃癌细胞系中检测到该基因的表达,并将其克隆到pEASY-Blunt载体中,酶切测序鉴定正确后,再将其连接到真核表达载体pCMV-HA中,酶切鉴定正确后转染293T细胞,Western-blotting测其表达。结果重组的携带有RNF11的真核表达载体酶切鉴定后显示载体及片段的大小正确,将该真核表达载体转染293T细胞后使用Western-blotting检测到了融合蛋白的表达。结论携带有标签蛋白的人RNF11基因的真核表达载体pCMV-HA-RNF11克隆及表达成功,为进一步研究其与其它蛋白质的相互作用奠定了基础。     

Decorin基因过表达对HEK 293T细胞微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl表达的影响

目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)重组质粒,研究其对微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl表达的影响。方法:从人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)提取总RNA,经RT-PCR获得decorin的全长cDNA,克隆至T-载体pUM-T并测序,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,再次测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,利用RT-PCR、Western Blot方法检测空载体组和重组质粒转染组微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl转录水平及翻译水平的表达。结果:经DNA测序证实人DCN cDNA片段正确插入真核表达载体中。Western Blot结果显示经磷酸钙共沉淀法转染的HEK 293T细胞中目的基因高表达。RT-PCR和Western Blot结果显示,与空载体组相比,重组质粒转染组LC3转录水平显著降低,beclin1和LC3-II的翻译水平均显著降低。结论:成功构建人DCN重组质粒,其在HEK 293T中过表达可以显著降低微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl表达,为进一步研究DCN与自噬的相互作用奠定了基础。     

重组人β-防御素基因在COS-7 细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达hBD-2的哺乳类动物型工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2 以进行COS-7细胞转染表达实验.将本室克隆获得的hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,并经DNA测序证明hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.通过脂质体转染法将pCMV.tag2B/hBD-2导入COS-7细胞.RT-PCR 法和免疫印迹法分别从mRNA 水平和蛋白质水平检测到被转染的COS-7细胞系能有效表达hBD-2.     

β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒，为进一步研究β-catenin在神经细胞内与其它蛋白质如tau、PSI的相互作用以及在阿尔茨海默病发病机制中的作用提供一种有用的工具。方法用亚克隆的方法将β-连环素基因插入到真核表达栽体pEGFP-C1，重组质粒pEGFP-cat瞬时转染野生型鼠成神经瘤细胞株．并在荧光倒置显微镜下观察转染效率。结果酶切鉴定和测序结果证实编码β-catenin的重组质粒构建成功，免疫荧光技术和免疫印记结果显示β-catenin-GFP融合蛋白在真核细胞中获得表达。结论成功构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在鼠成神经瘤细胞中表达了β-catenin—GFP融合蛋白。     

uPA基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因真核表达载体,并转染人肝癌细胞,为进一步体外研究uPA在肝癌发生发展中的作用奠定基础.方法:从肝癌组织中提取RNA,通过RT-PCR的方式,获得基因uPA的全长cDNA,并克隆于含有HA2-标签(tag)的真核表达载体pCMV上,酶切鉴定,质粒测序鉴定,用pCMV-uPA-HA2进行细胞瞬时转染及WesternBlotting鉴定.结果:经过测序证实得到获得包含uPA基因的pCMV-HA2真核表达载体,瞬时转染细胞有蛋白表达.结论:克隆了人肝癌的uPA基因,成功构建真核表达载体.