人骨膜细胞体外培养的实验

目的：观察体外培养的人骨膜细胞的形态学特征。方法：实验于2001-01／2003-10广东省粤北人民医院骨科和医学动物实验室完成。采用常规细胞培养法进行人骨膜细胞体外培养，并采用倒置显微镜和电子显微镜观察骨膜细胞生长情况、形态特征及超微结构。结果：①人骨膜培养活细胞光镜下形态：早期新生细胞呈梭形，饱满透明，立体感强；分裂期呈立方形或短柱状；后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形，分泌功能旺盛。②人骨膜细胞电镜下超微结构：胞体呈梭形，膜面有少量微绒毛状突起，粗面内质网丰富，有大量异噬体等次级溶酶体，线粒体体积较小、基质致密有少量嵴。具有原代细胞生物形态学特征。结论：人骨膜成骨细胞可经体外培养大量增殖，且细胞传代进化后，其形态学结构与原代细胞无明显差异，可用于细胞移植。     

骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞体外构骨的超微结构

背景：骨形态发生蛋白被证实有成骨诱导作用,然而关于骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞成骨的超微结构研究尚未见报道。目的：观察骨膜细胞经成骨因子骨形态发生蛋白7诱导后的生物活性及超微结构。方法：实验取材于成人胫骨。分离出原代骨膜细胞后行常规体外培养,实验分为实验组和对照组。实验组加入骨形态发生蛋白7和细胞培养辅助剂,对照组仅仅加入了成骨细胞培养辅助剂。每组分别在第5,10,15天设3个时间点,每个时间点设3个样本,分别行钙结节的染色及采用相差显微镜观察大体形态结构,在透射电镜下观察超微形态结构。结果与结论：实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好,形态一致。细胞早期呈梭形,立体感强,饱满透明,分裂期呈短柱状或立方形,电镜下见成骨细胞内有大量的粗面内质网和高尔基复合体;后期细胞由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形,后期射透电镜下可见细胞内有大量基质小泡,有膜包被,胞质内上有碱性磷酸酶及钙结合蛋白,泡内有钙盐结晶,成骨细胞的基底部和侧面出现突起与邻近的骨细胞突起相连。由骨形态发生蛋白7诱导的成骨细胞在体外增殖更快,细胞分裂及成骨速度更快。结果提示骨形态发生蛋白7在体外培养中具有明显增强成骨细胞增殖的能力。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法.方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～ 20 mL,全骨髓10％ FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代.对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质.结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14 d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性.结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能.     

家兔骨髓基质细胞培养后与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的相容性

目的:建立一套体外分离培养骨髓基质干细胞的方法,观察骨髓基质细胞的形态和生长规律,检测与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的细胞相容性。方法:实验于2004-10/2005-04在解放军第四军医大学唐都医院骨实验室完成。选取健康30d龄家兔40只,取幼兔长骨骨髓进行培养,观察其传代细胞生长特性和生长曲线。应用组织培养技术,对兔骨髓基质干细胞和聚乳酸-聚乙醇酸体外联合培养,相差显微镜观察和扫描电镜观察细胞生长情况。结果:实验纳入家兔40只,全部进入结果分析。①骨髓基质细胞不同接种时间的形态学观察:接种24h后可见大量密集的造血系细胞,有少量散在分布的贴壁细胞,呈多角形、短梭形;第3天可见形态各异、大小不一的贴壁细胞;第7天数量加速生长,己形成成纤维细胞集落,大部分细胞呈梭形,少部分呈多角形;第12天细胞融合成单层,从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列。②骨髓基质细胞接种72h后扫描电镜观察结果:早期可见培养板内细胞增多,并向聚乳酸-聚乙醇酸材料移行贴附于材料周边,部分细胞直接贴附于材料表面,随复合培养时间的延长而增多,细胞形态多为梭形及三角形,无细胞衰老及异常分裂现象。结论:兔骨髓基质细胞在体外培养条件下,早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,可作为骨组织工程学的种子细胞。聚乳酸-聚乙醇酸具有良好的细胞相容性,可作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的实验。     

骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞碱性磷酸酶的表达

背景：关于骨形态发生蛋白 7 作为刺激因子诱导细胞成骨的报道目前较少见。目的：观察骨膜细胞经骨形态发生蛋白 7 诱导后碱性磷酸酶的表达。方法：取材于成人胫骨骨膜,常规细胞培养法行骨膜细胞体外培养,分为实验组和对照组,分别加入骨形态发生蛋白 7 加成骨细胞培养辅助剂和单纯成骨细胞培养辅助剂,相差显微镜观察骨膜细胞形态特征及超微结构。每组分别在第 7,14,21 天设 3 个时间点,每个时间点设 3 个样本,采用碱性磷酸酶试剂盒法检测成骨细胞特异性标志物碱性磷酸酶表达情况。结果与结论：骨膜细胞经分组培养后,第 7 天时,实验组和对照组骨膜细胞均有明显增殖,碱性磷酸酶的可被检测出,但量不多,细胞外形为梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量稍多;第 14 天时,实验组及对照组骨膜细胞均显著增殖,细胞外形由梭形变为宽梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量明显增多。第 21 天时,实验组及对照组骨膜细胞均增殖,其中实验组细胞增殖明显,细胞外形为宽梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量显著增多。经过统计学分析由骨形态发生蛋白 7 诱导的骨膜细胞的成骨标志物碱性磷酸酶阳性率明显高于对照组（P 〈 0.01）。提示骨膜细胞具有良好的成骨和再生能力, 骨形态发生蛋白 7 能诱导骨膜细胞加强碱性磷酸酶的表达,能诱导骨膜细胞向成骨细胞转化。     

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

目的:改良成骨细胞分离培养方法,为骨形成、骨代谢以及骨组织工程等基础研究提供种子细胞。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。①无菌条件下取五六个月龄流产胎儿颅盖骨(家属知情同意),去除骨膜及周围结缔组织,然后用2.5g/L胰蛋白酶消化20min,终止消化后,去除骨缝组织,剪碎,将碎骨块接种于培养瓶中分离培养成骨细胞。②细胞纯化采用差速贴壁法。通过相差显微镜观察人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征。③用碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色等方法对所获得的成骨细胞进行鉴定。结果:①人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征:原代培养至第5天,骨块边缘出现零散的细胞,这些细胞的形态主要为梭形、三角形或多边形。原代培养第14天后,形成融合层,细胞呈圆形、卵圆形或方形紧密排列,叠层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞,细胞排列无方向性,出现集落样生长趋势。②人胚成骨细胞的鉴定结果:90%以上分离获得细胞碱性磷酸酶染色和钙结节染色均呈阳性。结论:采用酶消化后植块的改良植块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞,这些细胞具有典型的成骨细胞形态和功能,是一种较好的分离培养人胚成骨细胞的方法。     

人骨髓MSC分离培养及诱导分化为脂肪细胞的实验研究

目的建立一种分离纯化,培养扩增人骨髓MSCs的方法,并探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化人骨髓间充质干细胞,并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果MgCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L-DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论骨髓MSCs体外增殖和传代能力强,通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增;骨髓MSCs在体外可诱导分化为脂肪细胞。     

家兔骨髓基质细胞培养后与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的相容性

目的：建立一套体外分离培养骨髓基质干细胞的方法，观察骨髓基质细胞的形态和生长规律，检测与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的细胞相容性。 方法：实验于2004-10／2005-04在解放军第四军医大学唐都医院骨实验室完成。选取健康30d龄家兔40只，取幼兔长骨骨髓进行培养，观察其传代细胞生长特性和生长曲线。应用组织培养技术，对兔骨髓基质干细胞和聚乳酸-聚乙醇酸体外联合培养，相差显微镜观察和扫描电镜观察细胞生长情况。 结果：实验纳入家兔40只，全部进入结果分析。①骨髓基质细胞不同接种时间的形态学观察：接种24h后可见大量密集的造血系细胞，有少量散在分布的贴壁细胞，呈多角形、短梭形；第3天可见形态各异、大小不一的贴壁细胞；第7天数量加速生长，己形成成纤维细胞集落，大部分细胞呈梭形，少部分呈多角形；第12天细胞融合成单层，从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列。②骨髓基质细胞接种72h后扫描电镜观察结果：早期可见培养板内细胞增多，并向聚乳酸-聚乙醇酸材料移行贴附于材料周边，部分细胞直接贴附于材料表面，随复合培养时间的延长而增多，细胞形态多为梭形及三角形，无细胞衰老及异常分裂现象。 结论：兔骨髓基质细胞在体外培养条件下，早期生长性状稳定，增殖速度快，适应性强，可作为骨组织工程学的种子细胞。聚乳酸-聚乙醇酸具有良好的细胞相容性，可作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的实验。     

人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性

背景:高效、稳定地获得大量较高纯度的人脂肪干细胞,是其在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。目的:探索体外培养脂肪干细胞的适宜条件,从而提高其增殖能力。方法:采用胶原酶消化的方法,从人腹部皮下块状脂肪中分离出脂肪干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞、低糖培养基体外培养扩增。Giesam染色后观察细胞形态;绘制细胞生长曲线并进行细胞周期分析,观察分析传代后染色体核型改变;选取第3代脂肪干细胞做流式细胞鉴定、EdU细胞增殖能力检测以及克隆形成实验。结果与结论:分离培养的原代脂肪干细胞形态不一,经传代后的细胞形态趋于长梭形,排列紧密呈漩涡状生长。细胞生长曲线呈S形,细胞周期分析及EdU掺入法结果显示体外培养的脂肪干细胞具有较强的增殖能力。经染色体核型分析结果提示,体外培养不会引起脂肪干细胞的核型改变。第3代脂肪干细胞经流式细胞仪检测CD29,CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34和CD45呈阴性;克隆形成率为8.8%;在一定的诱导条件下,脂肪干细胞能够向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果说明采用胶原酶消化法可成功分离培养人脂肪干细胞,且具有较强的增殖能力。     

人脐静脉血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的 体外分离、培养及鉴定人脐静脉血内皮祖细胞。方法 密度梯度离心法分离培养人脐静脉血EPCs。、通过免疫荧光法观察内皮细胞吸收DiL-acLDL和FITC-UEA-I情况,流式细胞仪定量检测EPCs表面CD133、CD34和KDR抗原表达阳性率来鉴定EPCs。倒置显微镜下观察EPCs形态学变化,计数细胞并绘制生长曲线。结果 培养细胞呈长梭形,接种2-4 d梭形形态细胞较少,为细胞生长的潜伏期;6-10 d贴壁梭形细胞逐渐增多,为对数增殖期;10-14 d细胞融合成集落样生长,梭形细胞明显增多,进入生长平台期。激光共聚焦显微镜鉴定DiL-acLDL、FITC-UEA-I双染阳性的细胞为正在分化的EPCs;流式细胞仪检测结果 ：细胞表达CD133、CD34和KDR抗原的阳性率分别为：7.3＋2.71%、42.0＋6.42%、89.3＋10.45%。结论 从人脐静脉血可分离、纯化、扩增培养出内皮祖细胞。