腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒重组体构建

目的 构建大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒介导的表达载体。方法 提取大鼠脑组织总RNA．用逆转录PCR扩增DNA多聚酶β（POLB）的编码区，与T载体连接，作DNA测序后，酶切POLB基因并连入腺病毒穿梭质粒pAdTraek-CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。酶切鉴定，重组腺病毒质粒（pAd-polb）Lipofectamine2000转染293细胞，用293细胞扩增重组腺病毒。结果 8个TA克隆中有2个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLB cDNA序列完全一致。DNA序列正确的POLB重组腺病毒质粒Ad-polb转染293细胞后，荧光显微镜下可见绿色荧光。结论 用TA克隆和AdEasy系统，成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

编码绿色荧光蛋白和βARKct的重组腺病毒的制备

[目的]制备编码绿色荧光蛋白(GFP)和Gβγ活性抑制剂βARKct的重组腺病毒载体.[方法]构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-βARKct,经PmeI线性化后转化入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-I的BJ5183菌,筛选获得重组腺病毒质粒pAdEasy-gfp-βARKct.用LipoFectamine 2000将经PacI线性化的pAdEasy-gfp-βARKct转染入人胚肾293细胞,包装并扩增出重组腺病毒颗粒rAd-gfp-βARKct.用氯化铯高速梯度离心、纯化rAd-gfp-βARKct.用rAd-GFP-βARKct干预去甲肾上腺素诱导的乳鼠心肌细胞肥大过程,观察对β肌球蛋白重链(βMHC)基因表达的影响.[结果]将pAdTrack-CMV-βARKct转入含pAdEasy-I的BJ5183菌后获得20%的阳性重组体克隆.重组腺病毒质粒在293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有βARKct编码基因.透析纯化得到重组腺病毒滴度为6.0×106 pfu/mL.rAd-GFP-βARKct表达的βARKct可抑制乳鼠心肌细胞βMHC的高表达.[结论]成功构建重组腺病毒载体,并在293细胞中包装、制备出可表达βARKct的重组腺病毒rAd-gfp-βARKct.     

Hyper-IL-6融合基因重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达

目的 在扩增出融合基因Hyper-IL-6的基础上,构建重组腺病毒Ad-HIL-6.用Ad-HIL-6感染人肝细胞LO2,观察细胞内Hyper-IL-6 rnRNA和蛋白的表达情况.方法 将Hyper-IL-6克隆至穿梭质粒,线性化后与腺病毒骨架质粒在BJ5183细菌内同源重组,构建重组腺病毒质粒.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,PCR进一步证实重组腺病毒的存在.RT-PCR检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况,Western blot法检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6的蛋白表达情况.结果 酶切及PCR鉴定表明同源重组成功,重组腺病毒质粒转染293细胞后可见绿色荧光,感染293细胞得到大量病毒.重组腺病毒Ad-HIL-6能在LO2细胞中表达出Hyper-IL-6基因和蛋白,条带分另q为1600bp和60KD左右.结论 重组腺病毒AdHIL-6构建成功,为以后进行基因治疗奠定基础.     

人LMP-1基因腺病毒重组体的构建及其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达

目的：构建表达人 LIM矿化蛋白-1（LIM mineralization protein-1,LMP-1）基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）细胞系 U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达。方法：以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对 LMP-1进行扩增,通过TA克隆与 pGEM-T载体连接并DNA测序。双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒 pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和 DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达。线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在 BJ5183菌内完成与骨架质粒 pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒 Ad-LMP-1。通过脂质体介导,在 HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒 Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度。用 Ad-LMP-1感染OS细胞系 U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和 Western blot检测 LMP-1在 U2OS 细胞中的表达。结果：双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒 pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了 pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的 HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR 和 Western blot 验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组。通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5×109 pfu/ml。荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的 U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和 Western blot 检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的 mRNA和蛋白表达量明显高于对照组。结论：成功构建了人 LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础。     

携带人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒的构建和鉴定

[目的] 采用 Cre-LoxP同源重组系统构建并鉴定携带人胰岛素样生长因子-1( human insulin-like growth factor-1, hIGF-1)目的基因的复制缺陷重组腺病毒,为椎间盘退变的 hIGF-1基因治疗奠定基础.[方法] PCR合成 hIGF-1基因,用 pMD18-T载体克隆 hIGF-1目的基因,酶切、测序并进行 NCBI BLAST相似性在线分析.将 pMD18-T-hIGF-1和 pDNR-1r质粒分别行 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切, DNA 连接酶连接双酶切产物,转化感受态大肠杆菌 DH5α,合成中间载体 pDNR-hIGF-1,酶切鉴定.Cre-loxP系统介导 pDNR-hIGF-1和 pInt.AV1.SpaT同源重组形成 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1重组表达质粒,行 EcoRⅠ酶切鉴定.复苏 293细胞,将 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1和 pInt.B.B质粒在 293细胞内进行同源重组成含 hIGF-1基因的复制缺陷重组腺病毒.倒置显微镜观察 293细胞病变样效应( cytopathogenic effect, CPE);透射电镜观察 293细胞中的病毒颗粒;提取细胞裂解液中病毒 DNA, PCR鉴定 hIGF-1目的基因的存在; Western blot 检测 hIGF-1蛋白表达.用半数组织培养感染量 (tissue culture infectious dose 50,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度.[结果]克隆的 hIGF-1目的基因经 NCBI BLAST相似性在线分析证实与 Homo sapiens IGF-1 (GI:19923111)完全相同.pInt.AV1.SpaT-hIGF-1酶切鉴定,出现 5.4 kb和 1 kb两条片段,与理论值完全相符.转染 293细胞 12～ 14 d后,大部分细胞出现肿胀,脱落等细胞病变样效应.PCR鉴定细胞裂解液中含有 hIGF-1目的基因.Western blot 证实重组腺病毒表达 hIGF-1蛋白.第 2代腺病毒的滴度为 80× 106 PFU/mL.[结论]成功构建出含有 hIGF-1目的基因的复制缺陷重组腺病毒.     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.     

CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达

[目的]构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达.[方法]分离人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区(含绞链区-CH2-CH3)基因片段.将PCR产物克隆入pCDNA3,阳性重组子以双酶切和测序鉴定.将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183,经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体.采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒,进一步感染HepG2细胞,采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况.[结果]构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒,病毒滴度可达6×109 pfu/mL,并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig.[结论]成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体,为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具.     

乙酰胆碱受体四聚体前体α亚单位在人胚肾293细胞膜上的表达

[目的]将乙酰胆碱受体四聚体前体!亚单位重组质粒(pcDNA3.1-AchRα-BirA)转染至人胚肾293(HEK293)细胞,并在其细胞膜上获得稳定表达.[方法]提取重组质粒pcDNA3.1-AchRα-BirA,经限制性核酸内切酶Eco RⅤ单酶切后,行低熔点琼脂糖凝胶电泳检测.采用脂质体转染法,将pcDNA3.1-AchRα-BirA转染至HEK293细胞,经抗生素G418筛选后形成集落状抗性克隆细胞.将表达产物扩大培养,应用免疫荧光技术,以异硫氰酸荧光素标记,经荧光显微镜查看表达情况.[结果]电泳检查发现了大小约为6.964 kb的条带.转染后G418筛选获得抗性克隆细胞,经荧光显微镜观察到HEK293细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功地将AchRα-BirA基因转染至HEK293细胞膜上且有表达,为下一步构建AchRα四聚体奠定了基础.     

Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建间隙连接蛋白43（Cx43）和绿色荧光蛋白（GFP）双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达。结果（1）通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;（2）重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;（3）同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;（4）荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1-2d即有绿色荧光表达;（5）利用WesternBlot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强。结论Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功。     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

复制型HBV重组腺病毒的制备

目的 通过细茼体内同源重组方法,构建含1.3拷贝HBV DNA片段(HBV4.1)的HBV复制型重组腺病毒.方法 从质粒pTh-HBV4.1上获取HBV4.1片段,插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建含HBV4.1的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/HBV4.1.然后在大肠杆菌BJ5183内与pAdEasy-1进行同源重组,形成重组腺病毒质粒pAd-GFP/HBV4.1,经脂质体2000转染HEK293细胞进行包装和扩增,获得腺病毒Ad-CFP/HBV4.1.通过荧光显微镜下观察GFP绿色荧光蛋白的表达,检测腺病毒滴度和感染效率;采用PCR法检测腺病毒DNA上有无HBV基因组存在.结果 经酶切鉴定确认含HBV穿梭质粒pAdTrack-CMV/HBV4.1和重组腺病毒基因组质粒pad-GFP/HBV4.1构建成功;GFP荧光检测提示重组腺病毒Ad-GFP/HBV4.1已成功包装;PCR扩增表明重组腺病毒内携带有HBV DNA片段.在HEK293细胞中获得的病毒滴度可达(4.2～4.8)×107 efu/ml;当MOI为100时,感染HEK293细胞的效率>90%.结论 成功构建了携带1.3拷贝HBV基因组的重组腺病毒Ad-GFP/HBV4.1,为进一步建立高水平HBV复制型细胞和动物模型以用于HBV生物学特性的研究英定了基础.     

Hyper-IL-6重组腺病毒的制备

目的 探讨大量制备高滴度重组腺病毒的方法 .方法 以Pac-1酶切Hyper-IL-6重组腺病毒(AdHIL-6)质粒,乙醇沉淀回收DNA,将线性化的AdHIL-6质粒经脂质体转染293细胞进行病毒的包装扩增,以氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒,根据GFP(绿色荧光蛋白)计数法和有限稀释法原理测定病毒滴度及感染293细胞、L02细胞的MOI(Multiplicity of infection,感染复数),并以免疫细胞化学检测感染L02细胞后目的 蛋白Hyper-lL-6的表达.结果 收集的病毒液经PCIL扩增出目的 条带,测得病毒滴度为1.6×109pfu/mL,AdHIL-6感染293细胞、L02细胞的MO1分别是7和54,感染L02细胞后Hyper-IL-6强阳性表达.结论 成功地完成了Hyper-IL-6重组腺病毒的制备,为后续的腺病毒载体介导的基因治疗奠定了基础.     

miR-1腺病毒载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定microRNA-1(miR-1)的腺病毒表达载体。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAdprecusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率。结果基因测序及酶切鉴定证实重组Adprecursor-miR-1腺病毒载体构建成功;腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平。结论利用同源重组的方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达水平。     

靶向人血管内皮细胞生长因子-C基因的siRNA腺病毒载体的构建

目的利用AdMax腺病毒系统构建人VEGF-C-siRNA腺病毒载体并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法选择针对人VEGF-C mRNA的特异性siRNA靶序列,设计合成其相应的双链DNA,将其克隆入pDC316-EG-FP-U6载体中构建穿梭质粒pDC316-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,再与骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶、PCR检测和GFP表达证实成功地构建了携带VEGF-C-siRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带VEGF-C-siRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步抗肿瘤淋巴管生成的研究奠定了基础。     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

β-catenin腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人β-catenin基因的重组腺病毒载体,为进一步研究Wnt/Wingless信号通路在肿瘤发生发展中的作用机制奠定重要基础.方法:以含有β-catenin的pcmv-βNS-FC质粒为模板PCR获得目的基因,将目的基因定向克隆至腺病毒穿梭质粒构建阳性重组pAd track-β-catenin,并经PmeI线性化后在BJ5183细菌中与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1同源重组获得β-catenin重组腺病毒载体,再将PacI线性化的腺病毒质粒转染HEK293细胞包装重组腺病毒.结果:PCR及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至腺病毒质粒中,目的基因序列与GENEBANK报道一致,荧光显微镜可观察到GFP的表达.结论:成功构建pAd-β-catenin腺病毒质粒载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒.     

miR-1在心肌细胞生长中的调节作用

[摘要] 目的 构建并鉴定microRNA-1(miR-1) 的腺病毒表达载体,并探讨其在心肌肥厚中的介导作用。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片段,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAd-precusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率,并分析心肌细胞表面积及肥厚标志物ANP(Nppa)、β-MHC(myh7)的基因表达变化。结果 基因测序及酶切鉴定证实重组Ad-precursor-miR-1腺病毒载体构建成功,腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平,减小心肌细胞表面积及Nppa、myh7的表达。结论 利用同源重组方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达,抑制心肌细胞生长。     

携带人白细胞介素18基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建、鉴定和滴度测定

目的构建人白细胞介素18（IL-18）基因复制缺陷型腺病毒表达载体。方法以质粒pJWIL—18为模板，设计并合成上、下游引物，利用多聚酶链反应（PCR）扩增获得IL-18基因片段，酶切后克隆至pCA13质粒，构建重组质粒pCA13IL—18。鉴定正确后，将pCA13 IL—18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，9-12天出现病毒空斑。提取重组腺病毒的DNA。进行PCR鉴定。大量扩增后，氯化铯梯度离心纯化腺病毒，测病毒滴度。结果酶切分析、序列测定、PCR验证表明，IL-18基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体中。结论成功构建了表达人IL-18基因的复制缺陷性腺病毒载体。