人OAZ-ORF2基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

目的 克隆人鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白OAZ-ORF2基因,重组至真核表达载体,并在Hela细胞中表达.方法 以pET32a-OAZ质粒为模板,PCR法扩增OAZ-ORF2序列,测序鉴定后重组入真核表达载体pEGFP-N1,转染Hela细胞,表达重组蛋白.结果 PCR产物经琼脂糖电泳证实与目的基因长度一致,测序结果与GenBank公布的OAZ基因的ORF2序列一致.重组载体在Hela细胞中表达OAZ-ORF2蛋白,Western blotting分析在相对分子质量44.5×103左右出现新的蛋白条带.结论 成功构建人OAZ-ORF2基因真核表达载体,并获得表达.     

人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达

目的:从人类乳腺癌耐多柔比星细胞株细胞(MCF-7/Adr)中克隆CD44基因并构建CD44基因真核表达载体pcDNA3.1-CD44;将pcNDA3.1-CD44稳定转染入人乳腺癌细胞株(MCF-7)细胞中.方法:从MCF-7/Adr细胞中提取总RNA进行RT-PCR,获得全长的cDNA模板;将含有CD44基因的cDNA模板使用限制性内切酶进行双酶切获得带有酶切位点的CD44基因,再将带有酶切位点的CD44基因经TA克隆后测序验证,然后亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,双酶切鉴定后再次测序验证.脂质体法将pcDNA3.1-CD44质粒转染到MCF-7细胞中,48小时后RT-PCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF-7细胞的表达变化.结果:成功从人MCF-7/Adr细胞中克隆获得CD44基因并构建真核表达载体,转染后在MCF-7中检测到CD44基因mRNA和蛋白水平表达上调;将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF-7细胞经G418筛选两周后获得阳性克隆.结论:成功克隆和建立人CD44基因真核表达质粒;pcDNA3.1-CD44能在MCF-7细胞中表达;在MCF-7/Adr中新发现一种CD44基因的变异体(基因库号FJ216964);这为进一步研究其基因功能打下了基础.     

LETM1基因真核表达载体的构建

[目的]构建线粒体LETM1基因真核表达载体．[方法]从肾癌细胞株293T细胞中提取mRNA及合成cDNA,设计并合成线粒体LETM1基因引物,用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-6上,构建重组质粒pCMV-3Tag—LETM1,经酶切和测定序列进行鉴定．[结果]构建了重组质粒pCMV-3Tag—LETM1．[结论]成功地构建了线粒体LETM1真核表达载体．     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

人CD154基因真核表达载体的构建及在Eca109细胞中的表达

目的：构建人CD154基因真核表达质粒pcDNA3．1-CD154,初步观察转染该质粒后Eca109细胞的细胞生物学特性。方法：人外周血单个核细胞体外经PHA激活后提取总RNA,用RT—PCR技术扩增人CD154cDNA全长并构建真核表达质粒pcDNA3.1—CD154,用Lipofectamine^TM 2000介导pcDNA3．1-cDl54质粒转染食管癌Eca109细胞株,RT—PCR检测转染细胞中CD154 mRNA的表达,观察细胞生长特征。结果：用T7／SP6通用引物测序证实重组质粒中插入片段为正向插入的人CD154基因。pcDNA3．1-CD154转染Eca109细胞后细胞异型性明显改善,生长速率减慢。结论：pcDNA3．1-CD154构建成功;转染该质粒的Eca109细胞生物学特性发生改变。     

人穿孔素真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:观察克隆的人穿孔素(pfn)基因在COS-7细胞中的表达情况. 方法:用PCR方法获取人pfn全长基因,将所获基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1( ),转染COS-7细胞,RT-PCR检测pfn基因在COS-7细胞中的表达. 结果:成功获得人pfn全长基因,并构建了真核表达载体.转染COS-7后,检测出pfn基因的表达. 结论:人pfn全长基因可以在转染的COS-7细胞中表达.     

HYAL1基因过表达对乳腺癌细胞迁移能力和血管生成能力及增殖的影响

目的探讨透明质酸酶HYAL1基因过表达对人乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-30的迁移能力和血管生成能力以及增殖的影响。方法应用双室联合培养技术,建立体外肿瘤侵袭和血管生成模型,观察过表达HYAL1基因对乳腺癌细胞穿透ECM gel和诱导血管内皮细胞形成血管能力的影响;应用MTT和流式细胞术检测细胞的增殖能力变化。结果过表达HYAL1基因的乳腺癌细胞MCF-7和ZR-75-30(实验组)穿透ECM的能力以及诱导血管生成的能力均强于对照组(P<0.05);但是,过表达HYAL1基因的乳腺癌细胞增殖能力与对照组比较没有明显差异(P>0.05)。结论过表达HYAL1基因能促进人乳腺癌细胞在体外侵袭和诱导血管生成,但是对乳腺癌细胞的增殖没有影响。     

靶向人RIP RNAi真核表达载体构建及在人肝癌细胞Huh7细胞中的表达

目的:构建靶向人RIP的小分子干扰RNA(siRNA)真核表达载体(pSUPERpuro-RIP),在Huh7细胞系中瞬时表达后,检测其对RIP的沉默效果。方法:设计4对含RIP mRNA特异性序列的60 nt DNA链,通过基因克隆技术将其插入真核表达载体pSUPER-puro,构建重组pSUPERpuro-RIP siRNA载体,以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序验证其正确性。再瞬时转染Huh7细胞,Western blot检测RIP蛋白表达。结果:酶切测序证实载体构建成功,无碱基突变。Western blot结果表明pSUPERpuro-RIP siRNA在Huh7细胞系中有较好的沉默效果。结论:成功构建了靶向人RIP基因的siRNA载体pSUPERpuro-RIP siRNA。     

人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达

目的 构建STAT4基因的真核表达载体,在人胚肾细胞系HEK293中表达.方法 设计引物、采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获得STAT4的cDNA全长序列,在PCR产物两端加上SalI和BamHI限制性内切酶识别序列,将pEGFP-C1载体和PCR产物用SalI和BamHI进行双酶切,将STAT4 cD-NA定向克隆到pEGFP-C1中,从而构建了重组质粒pEGFP-STAT4;经酶切和测序鉴定正确后,将pEGFP-STAT4体外转染HEK293细胞,瞬时表达带有GFP标签的STAT4融合蛋白;采用荧光显微镜技术和免疫印迹技术检测融合蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增了2 247 bp的STAT4 cDNA全长,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pEGFP-STAT4转染HEK293细胞中,可检测到瞬时表达的GFP-STAT4融合蛋白.结论 成功构建重组质粒pEGFP-STAT4,在真核细胞HEK293中能被表达.     

真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1的构建及其在Siha细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRN1表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法：用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;Western Blot鉴定MKRN1在Siha细胞中的稳定表达.结果：RT-PCR成功地扩增出一条约1477 bp的片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western Blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Si-ha细胞中稳定表达.结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1,获得了稳定表达人MKRN1基因的Siha细胞克隆,为进一步研究人MKRN1的功能及其与细胞增殖及凋亡的关系提供了实验基础和重要的细胞模型.     

Hath1基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的：构建携带Hath1基因的真核表达载体并转染神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,观察其在SH-SY5Y细胞中的表达。方法： 从人全血中提取DNA,克隆Hath1基因,同时扩增色荧光蛋白（GFP）gfp基因;利用引物GFP-R和Hath1-F扩增融合基因gfp-Hath1,克隆至pMD18-T中;经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶酶切,构建重组表达质粒pCDNA3.1(+)::gfp-Hath1;转染SH-SY5Y细胞。结果：PCR扩增,融合基因gfp-Hath1扩增条带大小为2 023 bp,表明成功扩增gfp-Hath1融合基因。经双酶切鉴定,成功构建真核表达质粒pCDNA3.1(+)::gfp-Hath1。采用间接免疫荧光技术在荧光显微镜下观察到5H-SY5Y细胞中有GFP表达。结论：本研究成功地使Hath1基因在SH-SY5Y细胞中得到表达,为转染耳蜗组织的实验及探索治疗耳聋新方法奠定基础。     

大鼠野生型Egr-1基因及Egr-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth responsegene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Egr-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his-A和pGCsi.U6.neo.GFP中。经酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMC中,随后进行Western blot检测Egr-1蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性内切酶酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建正确。Westernblot分析表明,构建的pcDNA3.1/Egr-1质粒在大鼠GMC中能够表达;Egr-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:成功构建了大鼠野生型Egr-1基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究Egr-1基因的生物学功能提供了必要的实验工具。     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。     

真核表达载体pEGFP-N1-hSyntenin的构建及其在人脑胶质瘤细胞CHG-5中的表达

目的 构建pEGFP-N1-hSyntenin基因真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞CHG-5中的表达.方法 采用RT-PCR技术从人脑肿瘤组织中扩增hSyntenin,并将PCR产物双酶切后定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒.经过菌落PCR、双酶切及测序验证后,采用脂质体转染技术将pEGFP-N1-hSyntenin融合基因转染CHG-5细胞表达,G418筛选建立稳定表达hSyntenin的CHG-hS细胞系.采用荧光检测和免疫印迹技术分析hSyntenin在稳定转染的CHG-5细胞系中的表达.结果 菌落PCR鉴定出1个阳性克隆,阳性克隆经双酶切鉴定得到分别与载体和目的 片段大小一致的4.7 kb和897 bp的两条片段,测序证实目的 基因hSyntenin正确连接到pEGFP-N1的多克隆位点;pEGFP-N1-hSyntenin重组体稳定转染CHG-5细胞后,细胞荧光检测结果显示hSyntenin在CHG-5细胞质发出绿色荧光,免疫印迹检测可见32×103处的阳性条带.结论 成功构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒,并在人脑胶质瘤细胞CHG-5中获得稳定表达.     

组织型纤溶酶原激活剂真核表达载体的构建及其在乳癌细胞系MCF-7中的瞬时表达

目的:构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)真核表达载体,并检测其在乳癌细胞系MCF-7中的瞬时表达.方法:以含t-PA cDNA的质粒PETPFR为模板,PCR扩增目的片段t-PA,HindⅢ和Sal Ⅰ双酶切t-PA,HindⅢ和xhoⅠ双酶切pcDNA3真核表达载体.Sal Ⅰ和Xho Ⅰ的黏性末端互补,体外连接酶切产物,重组体转化感受态JM109细菌,筛选菌落和测序鉴定.以脂质转染胺试剂LipokctamineTM2000将pcDNA3-t-PA转染入乳癌细胞系MCF-7,G418筛选.应用原位杂交技术,以地高辛标记的t-PA cDNA为探针,显示t-PA在MCF-7中的瞬时表达.结果:电泳获得目的片段t-PA的条带2.1kb,初步鉴定为阳性重组体,测序证实为正确的t-PA序列.MCF-7细胞原位杂交显示大部分细胞表达阳性.结论:组织型纤溶酶原激活剂真核表达载体构建成功,可在乳癌细胞系MCF-7中表达.     

AKTIP基因真核表达载体的构建及其在GES-1细胞中的表达

目的:构建人蛋白激酶B相瓦作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIP cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DNA测序证实后,应用脂质体将AKTIP基因转染入人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,通过Western Blot检测其在GES-1细胞中的表达情况.结果:重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误,Western Blot结果显示AKTIP基因在GES-1细胞具有良好的表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1/myc-His(-)A-AKTIP真核表达载体,并成功地在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究AKTIP的功能和结构奠定了基础.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功。Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达,且IRF-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料。