中华蟾蜍DNA条形码鉴定

目的:通过DNA条形码研究鉴别中药材中华蟾蜍Bufo gargarizans Cantor及其混伪品的可行性。方法:从Gen Bank下载了6种蟾蜍属Bufo、2种林蛙属Rana、1种侧褶蛙属Pelophylax和1种小鲵属Hynobius的COI线粒体基因DNA序列。用Clustal X 1.81和Bio Edit软件分别对序列进行比对和编辑。利用MEGA 4.0软件按照Kimura双参数法计算种内和种间的遗传距离。用贝叶斯法和简约法构建系统发育树对中华蟾蜍进行鉴定。结果:构建的系统发育树表明,中华蟾蜍的所有样本聚类为一个单系,能很好地与其他混伪品区分。结论:COI条形码DNA序列能够对中药中华蟾蜍进行准确鉴定。     

利用DNA条形码检验中药制剂中的羚羊角药材

目的 研究以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角的可行性.方法 以不同厂家生产的8种含羚羊角中药制剂为材料,经充分研磨后,采用DNA提取试剂盒提取样品中DNA,以引物LCO1490和HCO2198或特异性引物0703扩增线粒体COI基因片段序列,PCR产物直接双向测序,将测序结果在GenBank中进行BLAST比对,并以DNAMAN和MEGA5.2软件构建同源树和NJ树,以赛加羚羊(gb|JN632700.1)和羚羊角标准药材序列为对照,判定制剂中羚羊角的真实性,并以Kimura-2-parameter模型计算种内、种间遗传距离.结果 8种中药制剂中羚羊角的COI基因序列长度均为658 bp,在同源树和NJ树中可与赛加羚羊和羚羊角标准药材聚成一支,并与outgroup完全分开.种内遗传距离为0～0.064,平均遗传距离为0.020,种间遗传距离为0.167～0.195.结论 以线粒体COI基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角方法是可行的,但因羚羊其他器官也含有相同基因,为保证检验结果的准确性,还需配合使用其他检验方法.     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

基于COI条形码的市售蝉蜕及其混淆品DNA分子鉴定研究

目的 利用COI序列对中药材蝉蜕Cicadae Periostracum及其混淆品进行DNA条形码鉴定研究,为蝉蜕药材的快速准确鉴定提供新的技术手段。方法 收集全国市售蝉蜕药材、基地自采蝉蜕及其混淆品总45份样本,同时采集江苏徐州黑蚱养殖基地不同树种中蝉卵样品5份作为对照。提取DNA,进行PCR扩增及双向测序,测序结果采用DNAMAN和SnapGene进行拼接校对,运用MEGA11.0进行比对分析,计算种内及种间Kimura 2-Parameter(K2P)遗传距离并构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统发育树。结果 黑蚱种内遗传距离远小于种间最小遗传距离,NJ树结果显示,黑蚱蝉蜕样品全部聚集为独立的一支,支持率为99%。混淆品样品分别聚集为单独的一支,支持率均大于90%,表明基于COI序列的DNA条形码技术可以有效鉴别蝉蜕药材真伪。结论 应用COI序列作为DNA条形码能够准确有效地鉴别蝉蜕及其混淆品。     

基于DNA条形码技术的毒性药材金钱白花蛇药源调查

目的:建立基于DNA条形码技术的毒性药材金钱白花蛇药源调查方法,调查市售金钱白花蛇的药源构成。方法:建立金钱白花蛇正品及其主要混伪品的参考细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)条形码库,收集51份市售金钱白花蛇样品,分别获取每份样品头部和尾部的CoⅠ序列,通过构建邻接系统发育树进行物种鉴定。结果:共获得60条金钱白花蛇正品及其主要混伪品的CoⅠ条形码,银环蛇种内最大遗传距离0.020 1,与金环蛇、赤链蛇和赤链华游蛇的种间最小遗传距离分别为0.156 1,0.208 8和0.209 3,种内最大变异小于种间最小变异;金钱白花蛇正品及其混伪品在邻接系统发育树上聚为独立的支,金钱白花蛇正品及其混伪品在系统发育树上可明确区分。所有市售金钱白花蛇样品均可从头部和尾部成功获得CoⅠ序列,药源调查结果表明银环蛇29份,赤链蛇20份,赤链华游蛇2份,混伪品占比43%;基于头部和尾部的鉴定结果一致。结论:DNA条形码技术可用于市售金钱白花蛇的药源调查;金钱白花蛇市场混乱、混伪品较多,质量问题严重。     

鹿茸饮片的DNA条形码鉴别研究

 目的 建立一种快速、准确和标准化的鹿茸饮片DNA条形码鉴别方法,并分析鹿茸药材原动物间的亲缘关系。方法 通过下载GenBank鹿类动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基 I(COI基因,经比对分析,在靠近COI 基因5′端设计了一对鹿科动物DNA条形码通用引物,对来源于鹿科动物3个属共计19份样本的鹿茸进行了PCR扩增和序列分析,并构建系统进化树。结果 通过遗传距离和分子系统树分析显示DNA条形码鉴别方法能够在属水平和种水平将鹿科3属9种鹿成功的鉴别开来,对90%的鹿茸样本可进行有效地鉴定,而梅花鹿、马鹿中各一个样本未得到准确鉴定,具体原因有待进一步研究。结论 所建立的鹿茸药材DNA条形码鉴别方法,准确可靠,可用于正品鹿茸马鹿和梅花鹿及其混伪品进行准确鉴定。     

地龙及其混淆品原动物的形态及DNA双重条形码鉴定

目的基于线粒体cytochrome coxidase I(CO I)和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

基于COI 条形码的中药材蛇蜕及其易混伪品的DNA 分子鉴定

目的：对中药材蛇蜕及其易混伪品进行分子鉴定,以确保该中药材的临床用药安全。方法：以COI 序列作为DNA 条形码,对蛇蜕原药材进行DNA 提取,PCR 扩增和序列测定,对13 个物种的68 份样品进行DNA Barcoding Gap 分析和系统聚类分析。结果：蛇蜕3 种基原黑眉锦蛇Elaphe taeniura Cope、锦蛇Elaphe carinata（Guenther）和乌梢蛇Zaocys dhumnades（Cantor）具有DNA Barcoding Gap,在邻接（NJ）系统聚类树上分别聚为独立一枝。结论：COI 作为DNA 条形码,不仅可以鉴定中药材蛇蜕的3 种基原,而且可以区分蛇蜕及其易混伪品,表明DNA 条形码可以用于中药材蛇蜕的鉴定。     

基于COI 条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA 分子鉴定

目的：利用COI 序列对蛤蚧药材及其常见混伪品进行DNA 条形码鉴定,为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法：以COI 作为条形码序列,对蛤蚧实验样品进行DNA 提取,PCR 扩增和双向测序,用MEGA6.0 对所有11 个物种的103 份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果：所有实验样品均可以获得COI 序列,蛤蚧COI 序列种内平均K2P 距离为0.005,种内最大K2P 距离为0.013,基于COI 序列构建的NJ 树中蛤蚧单独聚在一支,与其混伪品可以相互区分。结论：运用COI 条形码序列能够准确鉴定蛤蚧及其混伪品,为保障蛤蚧药材临床用药安全和市场监管提供新的方法。     

基于DNA条形码的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及混伪品等32种的鉴别

目的:利用DNA条形码线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因鉴别蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种蛇类。方法:收集蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品,对样品DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,扩增产物电泳后进行双向测序。应用Codon CodeAligner11.0.1软件对峰图质量进行比对、拼接,利用MEGA11.0软件对各物种碱基进行分析,构建邻接(NJ)系统聚类树并计算遗传距离。结果:NJ系统聚类树显示,蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种均独立聚为一支,眼镜蛇科与蝰科聚为一支,并与游蛇科并列聚类。游蛇科黄环林蛇、颈棱蛇与眼镜蛇科聚为一支,游蛇科赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇与蝰科聚为一支,锦蛇属玉斑锦蛇、黑眉锦蛇、百花锦蛇未聚为一支。结论:利用DNA条形码COⅠ基因能够准确鉴定蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种蛇类,赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇、黄环林蛇、颈棱蛇、玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇、宽吻水蛇、铅色水蛇、中国沼蛇、渔游蛇的种属归类有待进一步研究。     

鳖甲及其混伪品的DNA分子鉴定

目的:探讨快速、准确鉴定鳖甲及其混伪品的方法.方法:本文对中华鳖及其混伪品的COI序列用MEGA 4.0等软件进行遗传距离等分析,并构建中华鳖及其混伪品的NJ树.结果:中华鳖种内COI序列变异很小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离.由所构建的系统聚类树图可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成...     

基于COI条形码序列的金钱白花蛇及其混伪品的DNA分子鉴定

目的:利用COI序列对金钱白花蛇及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,考察其可行性.方法:对金钱白花蛇及其混伪品共4个种11份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及系统树中物种的聚类情况.结果:银环蛇COI序列种内变异较小,最大K-2P距离为0.0185,与混伪品的种间序列差异较大,种间最小K-2P距离为0.1561,种间最小K-2P距离远大于种内最大K-2P距离.由所构建的系统聚类树可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的支,银环蛇COI序列可以明确地与混伪品区分开.结论:运用COI条形码序列能够准确鉴定金钱白花蛇的基源动物及其混伪品,为金钱白花蛇的鉴别提供了新的方法,在其他动物药基源物种鉴定中也具有较大的应用价值.     

基于COI条形码序列的金钱白花蛇及其混伪品的DNA分子鉴定

目的:利用COI序列对金钱白花蛇及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,考察其可行性.方法:对金钱白花蛇及其混伪品共4个种11份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及系统树中物种的聚类情况.结果:银环蛇COI序列种内变异较小,最大K-2P距离为0.0185,与混伪品的种间序列差...     

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??OBJECTIVE To establish an accurate identification method of genuine Hippocampus based on COI sequences as DNA barcodes and analyze the relationship between the genuine and adulterants of Hippocampus. METHODS Two hundred and eleven pieces of COI sequences were collected from 21 Hippocampus species in this study. After PCR amplification and sequencing of the DNAs, the DNA barcoding gap and phylogenetic cluster analysis were carried out. RESULTS The COI sequences of the five authentic species all had obvious DNA barcoding gap. For phylogenetic cluster analysis, all of the samples were monophyletic and every species could be discriminated clearly. CONCLUSION COI is an effective DNA barcode for the identification of the genuine Hippocampus and its adulterants, and have important significance for clinical medication safety.     

基于COI条形码序列的珍珠母及其混伪品的DNA分子鉴定△

目的:探讨应用COI条形码序列对珍珠母及其混伪品进行物种鉴定的可行性。方法:用MEGA4.0等软件计算珍珠母及其混伪品种内及种间变异,构建珍珠母及其混伪品的NJ树。结果:珍珠母种内COI序列变异小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出,珍珠母不同来源个体均聚在一起,能够与其混伪品区分开。结论:基于COI序列的DNA条形码技术可以很好的鉴定珍珠母的正品来源及其混伪品。     

基于COI条形码序列的珍珠母及其混伪品的DNA分子鉴定

目的：探讨应用COI条形码序列对珍珠母及其混伪品进行物种鉴定的可行性。方法：用MEGA4．0等软件计算珍珠母及其混伪品种内及种问变异,构建珍珠母及其混伪品的NJ树。结果：珍珠母种内COI序列变异小,种问存在较多的变异位点,种问的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出,珍珠母不同来源个体均聚在一起,能够与其混伪品区分开。结论：基于COI序列的DNA条形码技术可以很好的鉴定珍珠母的正品来源及其混伪品。     

药用昆虫金环胡蜂及其混伪品DNA条形码鉴别研究

目的：以COI序列作为DNA条形码对药用昆虫金环胡蜂及其混伪品进行物种鉴别,探讨快速、准确鉴别金环胡蜂及其混伪品的方法。方法：以COI条形码序列为基础,对金环胡蜂及其近缘种混伪品黄纹大胡蜂进行总DNA提取、PCR扩增和双向测序,并比对GenBank中金环胡蜂及其混伪品的COI序列,继而用MEGA6.06软件对所有序列进行分析、计算种内及种间遗传距离,并用邻接（Neighbor-Joining,NJ）法构建出系统进化树。结果：金环胡蜂及黄纹大胡蜂COI序列扩增成功。金环胡蜂与其混伪品COI序列种间最小遗传距离为0.152±0.017,远大于金环胡蜂种内的最大遗传距离0.009±0.004。构建出的系统进化树图也明确显示,各物种都形成了独立的分支。结论：基于COI序列的DNA条形码技术可有效鉴别药用昆虫金环胡蜂及其混伪品,为其质量控制和市场监管提供了新的技术手段,保证金环胡蜂相关药材的安全性。     

基于DNA条形码对凉山虫草及近缘物种和其混伪品的分子鉴定

目的：结合ITS基因和COI基因对《四川省中药材标准》收录的凉山虫草和近缘物种及当地市场上出现的混伪品进行分子鉴定,考察其方法的可行性。方法：对收集的28份样品通过DNA提取、PCR扩增,分别获得其ITS 序列和COI 序列。用Codon Code Aligner V3.7.1,Mega 5.0等软件进行比对分析,构建基于ITS 序列和COI 序列的样品的NJ 树,进行聚类分析。结果：凉山虫草和近缘物种及混伪品寄生真菌的ITS 序列种间最小K-2P距离大于各物种种内最大K-2P距离：种内变异小,种间差异较大,从而基于ITS序列的NJ 树能将凉山虫草与其他近缘物种及其混伪品很好地归属;凉山虫草和近缘物种及其混伪品寄主昆虫的COI序列种间最小K-2P距离大于各物种种内最大K-2P距离：种内变异小,种间差异较大,通过遗传距离及NJ树的分析能将凉山虫草与其他近缘物种其及其混伪品及其他近缘物种很好地区分。结论：结合ITS序列和COI序列的DNA条形码技术可以很好地鉴定凉山虫草与其近缘物种及其混伪品,并对虫草属的系统学和分类研究提供了技术支持。     

藏药材榜嘎及其混伪品的DNA条形码鉴定研究

目的:利用DNA条形码技术对榜嘎及其混伪品进行鉴别,为藏药榜嘎的鉴定提供准确可靠的依据。方法:通过分析榜嘎及其混伪品ITS和ITS2序列的遗传距离、种内种间变异并构建NJ系统发育树,以评价ITS2和ITS序列的鉴定效率。结果:本研究中ITS2和ITS序列扩增效率相同,在blast比对和遗传距离距离分析上,ITS序列表现出更强的鉴定能力;通过K2P距离构建NJ树,ITS2和ITS序列在榜嘎与混伪品间的种间变异无统计学意义,但ITS序列对易混物种的鉴定效率较高。结论:ITS序列可作为鉴定榜嘎及其混伪品的有效条形码。