六味地黄丸增效小鼠黑色素瘤HSV-tk/GCV 自杀基因疗法的免疫机制

目的明确六味地黄丸是否增强单纯疱疹病毒核苷激酶/更昔洛韦（HSV-tk/GCV）自杀基因疗法对小鼠黑 色素瘤的免疫杀伤效果,并对其相关机制进行探索。方法采用Western Blot 实验、免疫荧光实验检测六味地 黄丸对缝隙连接蛋白43（Cx43）表达水平及膜定位的影响;通过荧光黄染料、钙黄绿素荧光传输实验检测六味 地黄丸对小鼠黑色素瘤细胞B16（B16 细胞）缝隙连接通讯（GJIC）功能的影响;PI/Hoechst 染色实验检测CD8+ T 细胞对B16 细胞的免疫杀伤效果;CD8+ T 细胞激活实验观察GJIC 在六味地黄丸增强对小鼠黑色素瘤免疫杀 伤中的作用。结果自杀基因疗法联合六味地黄丸治疗较单独应用自杀基因疗法能更显著地抑制肿瘤生长; Western Blot 及免疫荧光实验显示六味地黄丸组Cx43 表达明显上调,荧光传输实验显示六味地黄丸组B16 细 胞GJIC 功能显著增强;PI/Hoechst 染色实验显示,六味地黄丸组CD8+ T 细胞对B16 细胞的免疫杀伤效果更加 显著,阻断Cx43 后,对B16 细胞的免疫杀伤效果则被逆转,同时CD8+ T 细胞的激活也被减弱。结论六味 地黄丸可通过上调B16 细胞中Cx43 的表达,改善GJIC 功能,促进肿瘤抗原的交叉提呈,更强地激活CD8+ T 细 胞以增强其对肿瘤细胞的免疫杀伤效果。     

人参总皂苷增强小鼠黑色素瘤B16细胞缝隙连接功能的实验研究

目的探讨人参总皂苷(total ginsenosides,TGs)对小鼠黑色素瘤B16细胞缝隙连接(Gap junction,GJ)功能的影响及其作用机制。方法 MTT法测TGs对B16细胞生长的影响,荧光显微镜结合荧光示踪法分析GJ功能变化,以各试验组受体细胞均数与对照组的比值作为评价GJ功能的指标,流式细胞仪检测对照组和实验组的绿色荧光供体细胞(G4)与双阴性受体细胞(G3)比值(G4/G3)变化分析GJ功能改变,Western blot分析连接蛋白(Connexin,Cx)表达。结果 1~8μmol·L-1TGs处理B16细胞48 h对其生长状态无明显影响;用1,2,4,8μmol·L-1TGs处理细胞48 h后,荧光显微镜下观察,TGs能明显提高B16细胞荧光染料Calcein传递,对照组和实验组G4/G3比值分别是0.06±0.01,0.09±0.02,0.10±0.01,0.12±0.03和0.13±0.02,各实验组G4/G3值明显高于对照组(P0.01);Western blot分析结果显示,用1,2,4,8μmol·L-1TGs处理B16细胞48h对其连接蛋白Cx32表达有明显的增强作用,但对Cx43和Cx26表达无影响。结论体外较低浓度TGs能够有效促进B16细胞GJ功能,并具有一定的剂量-效应关系。1~8μmol·L-1TGs虽能显著促进B16细胞Cx32蛋白的表达,但在本试验浓度范围内并无明显的量效关系,且对Cx43和Cx26表达无明显影响。     

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的 探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法 制备六味地黄丸含药血清（分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清）及10.0%对照血清。 采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白（Cx）26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26－309、Cx26－337、Cx26－367、Cx26－2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26－2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能（gap junctional intercellular communication, GJIC）抑制剂甘草次酸（GA）对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组（简称低、中、高剂量组）及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20 mol/L,GA终浓度为50 mol/L。结果 六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43 mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率（48.75%、59.39%、69.28%）与阻断后细胞抑制率（29.14%、38.71%、58.13%）比较,显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。     

益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞actin、Cx43表达及GJIC功能的影响

目的观察益气活血中药复方对柯萨奇病毒B组3型(Coxsackie virus B3,CVB3)病毒性心肌炎心肌细胞间缝隙连接结构及通讯功能的影响。方法以免疫组化法检测正常组、病毒组、益气活血中药复方组心肌细胞肌动蛋白(actin)及连接蛋白(connexin43,Cx43)表达;,并以激光扫描共聚焦显微镜法检测各组心肌细胞荧光漂白恢复率。结果益气活血中药复方能上调CVB3病毒性心肌炎心肌细胞actin及Cx43表达,能显著改善细胞间缝隙连接通讯(GJIC)功能。结论益气活血中药复方具有对抗CVB3致心肌细胞骨架蛋白损伤,修复CVB3病毒性心肌炎心肌细胞间缝隙连接通道结构,改善CVB3攻击后心肌细胞GJIC功能的作用。     

牛蒡子苷元对人肝癌细胞HepG2缝隙连接蛋白表达的影响

目的：观察牛蒡子苷元在体外对人肝癌细胞HepG2缝隙连接蛋白（Cx）表达的影响。方法：采用Western blot 技术检测牛蒡子苷元对人肝癌细胞HepG2缝隙连接蛋白（Cx26/32/43）的表达。结果：Western blot 检测,用国产多克隆Cx一抗和进口单克隆Cx一抗的实验均显示：牛蒡子苷元等能明显提高人肝癌细胞HepG2Cx32的表达,且有时间、浓度依赖性,氧化剂H2O2能抑制牛蒡子苷元此作用;但牛蒡子苷元对HepG2的Cx43表达影响24h不明显,48h能明显提高Cx43表达。结论：牛蒡子苷元能提高人肝癌细胞Cx表达,增强细胞间缝隙连接功能。     

左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养MC3T3-E1细胞分化成熟过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:胰蛋白酶消化法传代培养MC3T3-E1细胞,通过血清药理学方法,设立正常对照组、左归丸组(5%、10%、15%)。分别用RT-PCR、Western blot法检测培养细胞第7、14、21天Cx43mRNA、蛋白表达;第21天划痕染料标记示踪法检测细胞GJIC功能。结果:随着培养时间增加,各组MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达逐渐增强;GJIC染料标记检测中,可见绿色荧光在划痕两侧扩散,荧光定量分析存在组间差异。各浓度左归丸含药血清均可促进培养细胞的Cx43mRNA和蛋白表达、增强GJIC功能,并与含药浓度正性相关,其中以10%组作用最显著(P0.05或P0.01)。结论:左归丸含药血清能增强MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达及GJIC功能,这可能是其促进MC3T3-E1细胞分化成熟的重要机制之一。     

GJIC渐弱剂18α-甘草次酸对兔脂肪细胞向成骨细胞横向分化的影响

目的探讨缝隙连接通讯渐弱剂18α-甘草次酸(GA)对脂肪细胞向成骨细胞横向分化及细胞间缝隙连接通讯的影响。方法选取3月龄新西兰大白兔腹股沟处脂肪组织,分离提取成熟脂肪细胞,使其去分化得到去分化脂肪细胞,取第三代去分化的脂肪细胞进行成骨诱导,加入GJIC渐弱剂18α-GA设为减弱组,并设立对照组,MTT法观察18α-GA对细胞倍增是否有影响,进行茜素红钙结节染色和I型胶原免疫组化染色对成骨细胞定性检测,Western blot技术和划痕标记染料示踪法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达。结果 MTT法检测结果显示18α-GA对细胞生长增殖无显著影响。茜素红染色显示均发现紫红色结节。免疫组化染色显示减弱组I型胶原表达减弱,SLDT法显示减弱组荧光染料扩散低于对照组,Western blot技术检测结果显示减弱组Cx43蛋白的表达下降。结论 18α-GA可以减弱缝隙连接通讯以降低脂肪细胞向成骨细胞分化的能力。     

温胆汤含药血清对谷氨酸条件下星形胶质细胞Cx43和GJIC功能的影响

目的:探讨温胆汤含药血清在10μmol/ml谷氨酸条件下对星形胶质细胞细胞缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能和连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达的影响。方法:将40只清洁级SD大鼠随机分为5组:正常组、氯氮平20 mg/kg组、温胆汤40 g/kg组、温胆汤30 g/kg组、温胆汤20 g/kg组,每组8只。正常组用等量生理盐水ig,氯氮平20 mg/kg组ig氯氮平20 mg/kg,温胆汤40、30、20 g/kg组分别ig温胆汤生药40、30、20 g/kg,1次/d,8天后处死取血,制备含药血清。星形胶质细胞在10μmol/ml谷氨酸条件下经含药血清处理,即10μmol/ml谷氨酸对照组、正常鼠血清组、氯氮平20mg/kg含药血清组、温胆汤40、30g、20 g/kg血清组,处理24、36、48 h后,采用细胞划痕染料标记示踪技术(scrape-loading and dye transfer,SLDT),以荧光染料在细胞间的扩散程度作为评价缝隙连接通讯的指标;Western blotting法检测星形胶质细胞中Cx43磷酸化和非磷酸化的表达。结果:10μmol/ml谷氨酸条件下,星形胶质细胞24h之后细胞凋亡数量明显,36h之后80%以上细胞处于凋亡坏死状态;划痕染料标记示踪技术直接检测GJIC中,温胆汤40、30 g/kg血清组在3个时间段不同程度的明显增加细胞GJIC,温胆汤20 g/kg血清组只在36h时间段增加细胞GJIC;10μmol/ml谷氨酸条件下,温胆汤40 g/kg含药血清使Cx43磷酸化下调和非磷酸化升高。结论:温胆汤含药血清可减少星形胶质细胞的凋亡;促进星形胶质细胞细胞缝隙连接通讯(GJIC);下调星形胶质细胞Cx43磷酸化,升高Cx43非磷酸化程度,从而对细胞缝隙连接通讯功能具有促进作用,这可能与其引起细胞内Cx43的异常活化有关。     

补阳还五汤通过调节血管平滑肌细胞Cx43作用于动脉粥样硬化的研究

目的:研究补阳还五汤抗同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管平滑肌细胞(HUVSMC)增殖的作用及其机制。方法:以14.9g/kg补阳还五汤剂量连续灌胃SD大鼠1周,提取补阳还五汤含药血清,并与胎牛血清(FBS)按一定比例,配置成20%(20%补阳)、10%(10%补阳+10%FBS)、5%(5%补阳+15%FBS)补阳还五汤含药血清组组。血管平滑肌细胞长满培养瓶或培养板后,用同型半胱氨酸分组造模,将细胞随机分为10组:空白组、模型组、乙酰半胱氨酸(NAC)组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组、NF-kB阻断剂PDTC组、MAPK阻断剂SB20组、ERK阻断剂PD98组、PKC阻断剂Stau组。蛋白质印迹法(Western blot)测定血管平滑肌细胞Cx43蛋白的表达量;RT-PCR技术检测各组血管平滑肌细胞Cx43 mRNA水平;建立血管内皮-平滑肌细胞共培养体系,Western blot分别检测内皮细胞和平滑肌细胞内Cx43的表达;电镜检测血管内皮-平滑肌细胞共培养体系细胞缝隙连接的变化。结果:Western blot实验中,平滑肌细胞与共培养体系中的内皮细胞、平滑肌细胞的Cx43蛋白表达水平,模型组与空白组比较,模型组中Cx43蛋白表达量均显著升高;乙酰半胱氨酸组,20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43蛋白表达显著下调。RT-PCR实验中,模型组与空白组比较,模型组中Cx43mRNA表达量显著升高;乙酰半胱氨酸组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43mRNA表达量显著降低。电镜检测细胞缝隙连接实验中:模型组与空白组比较,内皮-平滑肌细胞之间形成的缝隙连接遭到破坏,而20%补阳还五汤含药血清组却能形成与正常组相似的连接。结论:补阳还五汤可能通过下调Cx43蛋白以及其mRNA的表达,改善细胞之间的缝隙连接,减少血管平滑肌细胞增殖而发挥抗动脉粥样硬化的作用。     

左归丸含药血清对BMSCs成骨分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养大鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:密度梯度离心法制取BMSCs培养传代,通过血清药理学方法,设立正常对照A组、左归丸含药血清B组、缝隙连接阻滞C组。培养过程中进行细胞形态学观察;第14天分别采用RT-PCR、FRAP技术检测Cx43、β-catenin、BGPmRNA表达及细胞GJIC功能;第21天茜素红染色检测矿化结节形成情况。结果:左归丸含药血清能明显促进Cx43、β-catenin、BGPmRNA表达,与A组比较,P0.05;加用AGA后,Cx43、β-cateninmRNA表达无明显影响,而BGPmRNA明显下降,与B组比较,P0.05。FRAP检测镜下观察B组细胞内荧光恢复明显,其平均荧光恢复率与A、C组比较差异显著,P0.01。钙结节相对面积定量分析,B组显著高于A、C组,P0.05。结论:左归丸含药血清能增强BMSCs成骨向诱导分化过程中Cx43表达及GJIC功能,并与β-catenin、BGP基因在此过程中发挥协同作用。这可能是其促进BMSCs成骨分化成熟的重要机制。     

补阳还五汤对脑缺血再灌注后星形胶质细胞connexin43影响机制的研究

目的:探讨补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)的影响机制。方法:运用线栓法建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,补阳还五汤治疗1 d后ELISA法检测细胞因子[白细胞介素-1 beta,(IL-1β)和白细胞介素-10,(IL-10)]的表达,通过使用NF-κB激动剂增强炎症反应后,比较海马CA1区Cx43的表达,同时,使用HE染色观察细胞形态学改变。在补阳还五汤治疗7 d后,免疫组织化学染色法观察b FGF的表达情况,联合使用b FGF中和抗体后比较各组海马CA1区Cx43的表达同时HE染色观察细胞形态学改变。结果:同模型组相比,补阳还五汤组脑缺血再灌注1天后,IL-1β减少IL-10增加(P0.05);联合使用NF-κB激动剂后补阳还五汤对海马CA1区Cx43的下调作用被抑制(P0.05),HE染色显示联合组较补阳还五汤组神经元损伤加重。脑缺血7 d时补阳还五汤增强b FGF和Cx43的表达;联合使用b FGF中和抗体后海马CA1区Cx43的表达较补阳还五汤组降低(P0.05),HE染色显示同补阳还五汤组比,联合组神经元状态更差。结论:补阳还五汤在脑缺血后1 d可能是通过抑制炎症下调Cx43发挥保护作用,而在脑缺血后7 d可能通过上调b FGF增强Cx43促进修复。     

荧光双重标记Cx43在大鼠“足三里”表达的实验研究

目的:研究缝隙连接蛋白Cx43在大鼠“足三里”穴的表达及其与穴位、经络的可能关系。方法:20只健康成年SD大鼠随机分为非针刺组、针刺组,每组10只。应用荧光双重标记免疫组织化学方法和激光扫描共聚焦显微镜技术对成年大鼠皮肤肌肉组织的Cx43进行定位、定量分析。结果:皮肤肌肉组织中Cx43主要在表皮上皮细胞、皮下筋膜的肥大细胞中表达;非针刺组中穴位处Cx43的表达显著高于非经非穴处,两者相比有极显著性差异(P<0.01);穴位针刺后Cx43表达显著增加,与非针刺组中穴位比较有极显著性差异(P<0.01)。结论:电针可使“足三里”穴区皮肤及肌肉组织中的Cx43表达明显增加,缝隙连接蛋白及缝隙连接可能在经络活动中起重要作用。     

补阳还五汤通过Cx43促进脑缺血后修复

目的:探讨星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在补阳还五汤促进大鼠脑缺血再灌注后修复中的作用。方法:运用线栓法建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,将造模后的大鼠随机分为模型组,补阳还五汤(BYHWD)组和补阳还五汤联合Cx43抑制剂(BYHWD+Gap26)组,另设假手术对照组。在术后第1、3、7天对各组大鼠进行横木行走测试(BWT)和自发交替反应测试(SAB test);第7天取各组大鼠脑组织,采用高尔基染色法观察海马CA1、CA3和DG区神经元基、顶树突的长度,节点数,终末分支数以及树突棘密度的改变;采用免疫荧光法以CD31表达量计算海马CA1、CA3和DG区的微血管密度(MVD)。结果:与模型组比较,BYHWD组大鼠衡木行走测试评分降低(P0.05,P0.01),自发交替反应测试相对交替率升高(P0.05,P0.01);神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈增长的趋势;海马CA1、CA3和DG区MVD表达水平均升高(P0.05,P0.01)。相较于BYHWD组,BYHWD+Gap26组第7天大鼠横木行走测试评分更高(P0.05),自发交替反应测试相对交替率更低(P0.05);神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈下降的趋势;海马CA1、CA3和DG区MVD表达水平均显著降低(P0.01)。结论:补阳还五汤可通过星形胶质细胞Cx43促进神经元修复和血管再生,从而改善脑缺血再灌后的神经功能情况。     

Connexin 43在银杏叶提取物抗大鼠脑缺血损伤中的作用

目的通过体内体外实验研究缝隙连接蛋白43(Cx43)与EGb761脑缺血神经保护作用的关系,探讨银杏叶制剂EGb761治疗脑缺血的机制。方法在大鼠原代神经细胞中转染荷载Cx43-shRNA的慢病毒,干扰Cx43蛋白表达,同时给予EGb761 200μg/mL处理观察Cx43的表达以及EGb761对Cx43蛋白表达的影响。建立大鼠脑缺血模型,腹腔给予EGb761 50、100 mg/kg,使用HE染色,TTC染色,免疫组化和westernblot方法检测大鼠脑组织细胞的形态变化和大鼠海马Caspase-3,TUNEL阳性细胞,Cx43,p-Cx43蛋白的表达变化。结果 EGb761给药可以减少脑缺血大鼠脑组织梗死面积,显著性抑制脑缺血大鼠海马Caspase-3表达和TUNEL阳性凋亡细胞数目,显著性抑制大鼠海马神经细胞p-Cx43的表达水平。体外培养的大鼠神经细胞转染Cx43-shRNA慢病毒,给予EGb761处理,处理前后神经细胞Cx43/p-Cx43蛋白表达未见明显变化。结论 EGb761可以减轻脑缺血缺氧引起的细胞损伤,其神经保护作用与抑制缺血引起的缝隙连接蛋白Cx43的表达和激活有关。     

敲除缝隙连接蛋白Cx 43基因对针刺抑制小鼠内脏痛反应的影响

目的:探讨缝隙连接蛋白43(Cx43)影响针刺镇痛作用的可能中枢和外周机制。方法:将野生型(WT)和Cx43基因敲除杂合子(HT)小鼠随机分为6组:WT空白对照组、WT模型组、WT针刺组、HT空白对照组、HT模型组和HT针刺组,每组18只,腹腔注射0.6%醋酸(0.1 mL/10 g)制造内脏痛模型。针刺"中脘"、双侧"足三里"穴,每5 min捻针30 s,共30 min。比较各组小鼠首次扭体潜伏期、20 min扭体反应次数。放射免疫法检测下丘脑β-内啡肽(β-EP)和血清前列腺素E2(PGE2)含量。结果:HT与WT空白对照组小鼠首次扭体潜伏期、20 min扭体反应次数、下丘脑组织β-EP和血清PGE2含量差异均无显著性意义(P>0.05)。与对照组比较,HT和WT内脏痛模型组小鼠首次扭体潜伏期明显缩短(P<0.01),20 min扭体反应次数显著增加(P<0.01),下丘脑β-EP和血清PGE2含量明显升高(P<0.05);两模型组间上述各指标差异均无显著性意义(P>0.05)。与模型组比较,WT针刺组小鼠首次扭体潜伏期明显延长(P<0.01),扭体反应次数明显减少(P<0.01),下丘脑组织β-EP含量显著升高(P<0.05),血清PGE2含量显著降低(P<0.05)。HT针刺组小鼠各项指标与模型组比较差异无显著性意义(P>0.05)。HT针刺组首次扭体潜伏期、下丘脑β-EP含量明显低于WT针刺组(P<0.05),而HT针刺组扭体反应次数和血清PGE2含量明显高于WT针刺组(P<0.05)。结论:针刺缓解腹腔内脏痛的作用可能是通过促使中枢和外周镇痛物质β-EP增加、致痛物质PGE2减少而实现的。Cx43与针刺镇痛效应有着密切联系。     

连夏配方颗粒对心肌梗死大鼠室颤阈值和连接蛋白43重构的影响

目的:探讨连夏配方颗粒对心肌梗死大鼠室颤阈值和连接蛋白43(Cx43)重构的影响。方法:通过结扎大鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、连夏配方颗粒高、中、低剂量组和美托洛尔组,另设假手术组。干预30 d后采用在体程控电刺激检测大鼠室颤阈值;RT-PCR法检测左心室心梗边缘区P38mRNA、Cx43mRNA的表达;免疫组织化学染色检测Cx43的密度和分布;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果:与假手术组比较,模型组大鼠室颤阈值显著降低,Cx43mRNA表达下降,分布紊乱,血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,连夏配方颗粒高、中剂量组大鼠室颤阈值提高(P<0.01,P<0.05),Cx43mRNA表达增加(P<0.05),Cx43分布改善,血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA的表达显著降低(P<0.01)。结论:连夏配方颗粒可提高心梗大鼠室颤阈值,其机制可能与减轻炎症反应,改善连接蛋白43重构有关。     

通心络对异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大及Cx43mRNA表达的影响

目的:观察通心络(Tongxinluo,TXL)超细干粉水提物对异丙肾上腺素(isoproterenol,Iso)诱导的H9c2心肌细胞肥大的作用,并探讨其对缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)mRNA表达的影响。方法:将培养的H9c2心肌细胞随机分为对照组、TXL组、Iso组和Iso+TXL组,通心络以通心络超细干粉水提物的形式加入,使用异丙肾上腺素诱导72 h后,采用相差显微镜测量细胞大小,BCA法测定蛋白浓度,运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定Cx43mRNA的表达。结果:Iso刺激H9c2心肌细胞72 h后,Iso组细胞直径增大,高于对照组(P<0.05);通心络对正常H9c2心肌细胞直径无明显影响,但能抑制Iso诱导的细胞直径增大(P<0.05)。Iso组蛋白浓度明显升高,高于对照组(P<0.05);通心络对正常H9c2心肌细胞蛋白浓度无明显影响,但能抑制Iso诱导的蛋白浓度的升高(P<0.05)。Iso组Cx43mRNA表达明显减少,低于对照组(P<0.05);通心络对正常H9c2心肌细胞Cx43mRNA表达无影响,但能够抑制Iso诱导的Cx43 mRNA表达的下调(P<0.05)。结论:通心络可以抑制Iso诱导的H9c2心肌细胞肥大及Cx43mRNA表达的下调。     

补肾活血方对BPH模型大鼠膀胱逼尿肌缝隙连接蛋白表达的影响

目的:观察补肾活血方补肾活血方对前列腺增生大鼠膀胱逼尿肌缝隙连接蛋白43(Cx43)mRNA及蛋白表达的影响。材料与方法:清洁级雄性Wistar大鼠48只,随机分为正常组、模型组、模型加补肾活血方组、模型加坦索罗辛组四组。除正常组外,其它实验大鼠以去势加睾酮注射法复制大鼠BPH模型。于去势第一天起,各组大鼠分别给予相应药物灌胃。模型+补肾活血方按1mL/100g/日体重予补肾活血方(由淫羊藿、枸杞子、穿山甲、丹参、菟丝子等组成,含生药量2.34g/ml)灌胃,模型加坦索罗辛组按1.8μg/100g/日体重予坦索罗辛灌胃。其余各组予等体积生理盐水灌胃。均每日1次,连续38天后检测各组大鼠膀胱逼尿肌组织Cx43 mRNA及蛋白表达。结果:与空白组相比,模型组Cx43 mRNA表达明显上升(2.08 vs 30.69,P0.01),坦索罗辛及补肾活血方组Cx43 mRNA表达与空白组相比也有升高,但无统计学差异(16.05,12.74,2.08,P0.05)。与模型组相比,补肾活血方(12.74 vs 30.69,P0.01)Cx43 mRNA表达明显下降。与空白组相比,模型组及补肾活血方、坦索罗辛等各组Cx43蛋白表达明显上升(分别为1.44,3.89,1.86,2.73),而补肾活血方、坦索罗辛各组与模型组相比,Cx43蛋白表达均明显下降(P0.01)。结论:补肾活血方组可以明显降低BPH模型大鼠膀胱组织Cx43 mRNA及蛋白表达,这可能是补肾活血方有效改善BPH继发膀胱改变的机制之一。     

内质网应激凋亡途径对H9C2细胞缝隙连接蛋白43表达的影响及稳心颗粒的干预研究

目的：研究内质网应激凋亡途径对大鼠心肌H9C2细胞缝隙连接蛋白43（Cx43）表达的影响及稳心颗粒的干预作用。方法：体外培养H9C2细胞,分为对照组、模型组、salubrinal（Sal）组、稳心颗粒组;采用毒胡萝卜素（TG）诱导内质网应激凋亡模型,以经典凋亡抑制剂Sal抑制凋亡,采用CCK-8比色分析法筛选药物浓度及时间,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting法检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP-同源蛋白（CHOP）、天冬氨酸胱氨酸特异性蛋白酶-12（Caspase-12）、Cx43的表达。结果：CCK-8结果提示,TG、Sal和稳心颗粒的最佳浓度分别为0.1、20 μmol·L-1和10 g·L-1,作用时间均为24 h。流式细胞仪检测结果显示,与对照组比较,其余3组的细胞凋亡率显著增加;与模型组比较,Sal组及稳心颗粒组的细胞凋亡率都明显下降。Western blotting结果中,与对照组比较,模型组细胞GRP78、CHOP及Caspase-12蛋白表达水平显著增高,而Cx43蛋白表达水平显著降低;与模型组比较,Sal组和稳心颗粒组细胞CHOP、Caspase-12蛋白表达水平显著降低,Cx43蛋白表达水平显著升高,Sal组细胞GRP78蛋白表达差异无统计学意义,稳心颗粒组GRP78蛋白表达水平显著升高。结论：TG诱导的内质网应激凋亡途径会影响Cx43的表达,稳心颗粒可以通过抑制内质网应激凋亡途径调节H9C2细胞Cx43的表达水平。     

Reduction of Ischemic Brain Edema by Combined use of Paeoniflorin and Astragaloside IV via Down‐Regulating Connexin 43

Paeoniflorin (PF) and astragaloside IV (AS‐IV) have protective effects on cerebral ischemia. We aimed to test the effects of combined use of PF and AS‐IV on ischemic brain edema and investigate whether the effects were dependent on connexin43 (Cx43). We detected the expression of Cx43 induced by PF and AS‐IV after cerebral ischemia. We also examined the effects of combined use of PF and AS‐IV on ischemic edema and further investigated the related pathways. We demonstrated PF and AS‐IV decreased Cx43 and aquaporin4 (AQP4) associating with reduction of brain edema by dry‐wet weight and brain‐specific gravity methods after cerebral ischemia. Administration of PF and AS‐IV displayed a further attenuation of brain edema with lower Cx43 levels. Meanwhile, Cx43 blockade inhibited AQP4 down‐regulation by the two drugs. Moreover, phosphorylation of C‐Jun amino‐terminal kinase (JNK) and extracellular signal‐regulated kinase (ERK) were increased by PF and AS‐IV, respectively. The effects of PF and AS‐IV to down‐regulate Cx43 were suppressed by JNK and ERK inhibitors, respectively. Our data indicate that PF and AS‐IV alleviate ischemic brain edema, which has close relation to Cx43 down‐regulation causing decrease of AQP4 via JNK and ERK pathways activation, respectively. Combined administration elicits synergistic effects on brain edema reduction. Copyright © 2017 John Wiley & Sons, Ltd.