神经干细胞定向诱导分化为神经元的方法学研究进展

<正>神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种多功能干细胞,具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。体外培养的NSCs经血清自然诱导分化或移植入脑损伤模型后形成的神经元数量相对较少,大部分都分化为胶质细胞,这对NSCs的应用产生较大阻碍。近来研究尝试把某些药物制剂、激素作为NSCs诱导培养基的添加剂,或将NSCs与其它细胞共培养,以增加NSCs定向分化为神经元的数目。     

冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的：观察应用10％牛血清白蛋白＋20％二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后，其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：实验于2004-02／2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后，培养于含10％牛血清白蛋白和20％二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中，在液氮中分别冷冻保存6，12，及18个月后，重新复苏培养于神经干细胞培养液中，并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。 结果：①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后，除少数细胞贴壁死亡外，多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6，12，18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为（15．3&;#177;3．4）％，（16．2&;#177;1．8）％，（15．6&;#177;2．2）％，（16．7&;#177;2．8）％，方差分析显示各组间差异无显著性（F=1．799，P〉0．05）。 结论：冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养向胆碱能神经元的分化

目的在一定条件下对胚胎大鼠脊髓神经干细胞进行体外培养与诱导,观察其向胆碱能神经元的分化情况,并进行鉴定。方法选取孕龄17 d的Wistar大鼠5只,利用胚胎大鼠进行脊髓源神经干细胞分离与培养,并进行神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的细胞免疫荧光鉴定。对神经干细胞进行胆碱能神经元定向诱导分化,对照组为单纯诱导培养基,其余各组以诱导培养基为基础,添加生长因子,分为维甲酸(RA)组、音猬因子(SHH)组、SHH+神经营养因子-3(NT-3)组、SHH+RA组,每组1只。细胞诱导分化14 d后,进行细胞免疫荧光染色,观察各组胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性细胞比率与细胞分化情况。结果经诱导分化后,神经干细胞向胆碱能神经元进行分化。培养14 d,大部分神经细胞从神经干细胞球中央迁出,神经细胞间突起发生交错,呈现出网状结构。经免疫荧光检测,可观察到细胞胞质呈现出红色荧光。对照组未发现Ch AT阳性细胞,SHH、RA诱导组可观察到少量的Ch AT阳性细胞,SHH+NT-3组和SHH+RA组则可以观察到较多的Ch AT阳性细胞。经统计学比较,SHH+NT-3组和SHH+RA组Ch AT阳性细胞比率均显著高于对照组、RA组、SHH组,差异均具有统计学意义(P 0.05),且SHH+NT-3组和SHH+RA组组间比较,对照组、RA组、SHH组两两比较,差异均无统计学意义(P 0.05)。结论在添加一定生长因子的条件下对胚胎大鼠脊髓神经干细胞进行体外培养,可以诱导其向胆碱能神经元分化。     

诱导时间对体外培养大鼠神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

背景:近年来通过筛选不同细胞因子的诱导分化作用发现,某些特定的细胞因子配伍可明显诱导中脑神经干细胞体外定向分化成多巴胺能神经元,研究还发现神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元可以有效应用于移植治疗帕金森病,为提高其体内移植的疗效,目前迫切需要深入研究神经干细胞诱导分化的生物学特性.目的:探讨大鼠神经干细胞在分化液中诱导不同时间后,其体外分化成多巴胺能神经元的效应.设计:单一样本观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-05/10在中山大学附属第一医院完成,选择清洁级孕14 d的健康SD大鼠6只,体质量350-400 g,由中山大学动物实验中心提供(许可证号码SCXK(粤)2007-0034).实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:①在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.②经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.③诱导分化2,4,6,8,10 d后,流式细胞仪检测分化细胞中酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.主要观察指标:①大鼠神经干细胞诱导分化后细胞形态的变化.②诱导不同时间的大鼠神经干细胞分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.结果:在诱导分化液中大鼠中脑神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,分化6 d后,多数细胞已生长出一两个长突起及多个短突起.免疫细胞化学显示分化的细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2,4,6,8,10 d的分化细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比例分别为(3.2±0,9)%,(6.8±1.6)%,(16.7±2.6)%.(14.8±1.8)%,(12.2±2.5)%,各组间差异有显著性意义(F=26.449.P＜0.05).结论:诱导时间对大鼠中脑神经干细胞体外分化成多巴胺能神经元的能力存在影响,诱导6 d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比例最高.     

抗坏血酸诱导新生鼠神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键.目的:观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成.材料:清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供.抗坏血酸为Sigma产品.方法:取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108L-1密度接种.设立4组:空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2%B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导.主要观察指标:RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率.结果:各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶mRNA.神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原.与空白对照组比较,50,100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μ mol/L(P<0.05),100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P>0.05).结论:从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力.50～200 μ mol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化.     

维甲酸诱导胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元的分化

背景:目前认为直接进行神经干细胞移植后细胞虽能存活,但是只分化成神经胶质细胞,并不能分化成有功能的神经元.目的:探讨维甲酸诱导对胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-09/2009-02在辽宁医学院科技实验楼完成.材料:胚龄13.5 d的SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:分离胎鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化法体外培养获得神经干细胞.将原代和传代细胞以1×107L-1接种到培养孔中,分别进行常规贴壁分化培养和维甲酸诱导分化培养.主要观察指标:神经干细胞的鉴定,光镜及免疫组化检测神经干细胞诱导分化结果.结果:免疫组织化学检测结果显示,原代和传代后得到的神经干细胞团均呈巢蛋白阳性.常规贴壁分化培养7 d后,神经元多呈椭圆型和近似三角形,胞体大,细胞边缘清楚,胞体上有多个突起;而维甲酸诱导分化培养后,神经元数量增加,形态清楚,但细胞胞体上突起较少.与常规贴壁分化培养比较,维甲酸诱导分化培养后神经干细胞向神经元分化率明显升高(P<0.01),神经干细胞向神经胶质细胞分化率明显降低(P<0.01).结论:从大鼠胚胎脑海马组织中分离得到可自我复制和多向分化的神经干细胞,维甲酸体外诱导后可以增加其向神经元方向分化的比例.     

大鼠胚胎神经干细胞体外分化时间的特异性

背景：目前对于神经干细胞体外培养过程中神经干细胞自身分化特性的变化研究的较少。目的：观察大鼠胚胎神经干细胞体外分化的时间特异性。方法：利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质神经干细胞,取不同培养时间的神经干细胞进行诱导分化,检测其分化特性的改变。结果与结论：体外培养的神经干细胞早期分化以神经元为主,随着培养时间的增加,分化成神经元的比例下降,神经胶质细胞的比例增加,而神经干细胞分化成少突胶质细胞的潜能与培养时间无明显相关。提示体外培养的神经干细胞其分化成神经元的潜能随着培养时间的增加而降低,而分化成神经胶质细胞的潜能随培养时间的增加而增加,神经干细胞分化为少突胶质细胞的潜能无时间相关性。     

冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的:观察应用10%牛血清白蛋白 20%二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后,其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。方法:实验于2004-02/2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后,培养于含10%牛血清白蛋白和20%二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中,在液氮中分别冷冻保存6,12,及18个月后,重新复苏培养于神经干细胞培养液中,并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。结果:①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后,除少数细胞贴壁死亡外,多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后,免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6,12,18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为(15.3±3.4)%,(16.2±1.8)%,(15.6±2.2)%,(16.7±2.8)%,方差分析显示各组间差异无显著性(F=1.799,P>0.05)。结论:冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的：比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性，为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法：实验于2004-11／2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养，每3天换液1／2，每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中，补足神经干细胞分化培养基，继续培养7d，进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定，以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力，并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果：①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果：胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞，并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果：原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应，结合悬浮培养有神经球形成的现象，证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数，阳性率的比较：两组培养1，3，7，11，14，28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异（t=2．41～92．7l，P〈0．01或0．05）。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定：胚胎鼠及新生鼠的MAB阳性细胞分别为（32．6&;#177;5．6）％，（30．7&;#177;6．7）％，抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为（47．5&;#177;9．4）％，（50．3&;#177;8．9）％，P均〉0．05。结论：从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞，表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin，并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强，更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

胚胎干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化调控

中脑多巴胺能神经元在自主运动、情绪行为及认知方面发挥了重要作用,这类神经元的缺失是帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的发病基础。胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）可在体外无限增殖并向多巴胺能神经元分化,被认为是PD细胞替代治疗的重要细胞来源,从而成为近几年来的研究热点。本文就多巴胺能神经元的体内发育调控和诱导非人类及人类ESC向多巴胺能神经元分化主要方法的研究进展作一介绍,并讨论其中存在的问题。     

不同胎龄大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的比较

背景:胚胎来源干细胞的分化潜能不仅受到诱导条件影响,也受来源胚胎胚龄的影响.目的:实验拟观察不同胎龄大鼠中脑神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化能力.设计:随机对照观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-03/2007-09在中山大学附属第一医院实验室完成.成年孕SD大鼠30只,体质量350～400 g,由中山大学动物实验中心提供.许可证号码为SCXK(粤)2007-0034.实验过程中对动物处置符合动温桌硌П曜?DMEM/F12无血清培养液、B27添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为0.1的胎牛血清为英国Gibco公司产晶;白细胞介素1α,白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子购自美国R&D公司:白血病抑制因子购自英国PEPROTECH公司:酪氨酸羟化酶抗体购自美国Santa Cruz公司;巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体及胶质纤维酸性蛋白抗体为美国CHEMICON公司产品.方法:①分别于大鼠孕10,12,14,16,18天摸球法随机选取6只,麻醉后处死孕鼠,无菌条件下剖腹取胚胎,分离中脑腹侧脑组织进行神经干细胞培养.在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中分别培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞,经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.②诱导分化6 d后观察分化细胞生长情况并进行免疫细胞化学鉴定:酪氨酸羟化酶染色标记后通过流式细胞仪检测分化的多巴胺能神经元比率.主要观察指标:①不同胎龄大鼠神经干细胞诱导分化后生长情况及免疫细胞化学鉴定结果.②神经干细胞诱导分化后酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率.结果:①孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞球在诱导分化液中贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向外呈放射状生长,分化6天的细胞多数有1～2个长突起或有多个短突起.神经球经巢蛋白免疫细胞化学染色,大部分细胞胞浆染色呈阳性.②孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞在诱导分化液中培养6 d后.流式细胞仪检测其诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比率分别为(10.3±2.5)%,(21.6±3.4)%,(16.7±2.8)%,(14.2±3.2)%,(8.9±1.8)%,各组间比较差异均有显著性意义(P<0.05),其中孕12 d大鼠中脑神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.结论:不同胎龄大鼠中脑的神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的能力不同,以孕12 d诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.     

脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景:神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞,培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元,从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30%。目的:以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂,观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。材料:清洁级孕14~17d的SD大鼠10只,诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品,胎牛血清为杭州四季青产品。方法:孕鼠处死后取出胚胎,剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞,锥虫蓝染色计数,调整细胞密度为2×106,添加B27及碱性成纤维细胞生长因子,置于37℃、体积分数为0.05的CO2恒温箱中原代培养,待细胞克隆球明显增大、中央变暗时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组,诱导组添加体积分数为0.01的胎牛血清 20μg/L脑源性神经营养因子共培养,血清对照组仅添加体积分数为0.01的胎牛血清。主要观察指标:在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5d后,行神经元免疫组化鉴定,流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3d的两组细胞,RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。结果:原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球,形态规则,立体感强;悬浮生长的克隆球经诱导分化后,逐渐失去其球状的立体外观,邻近克隆球发出的突起可相互连接,3d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达,诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较,诱导组神经元阳性细胞率显著升高(χ2=16.0,P<0.05)。与未分化的神经干细胞比较,诱导组、血清对照组细胞MASH-1的表达均明显升高,且前者升高幅度明显强于后者(F=21.7,P<0.05)。结论:脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化,可能与内源性bHLH基因MASH-1的表达升高有关。     

体外诱导脂肪基质干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:鉴于脂肪干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化和扩增、可进行自体移植并有多项分化潜能等特点,有学者认为其可作为治疗帕金森病的种子细胞来源。目的:观察大鼠脂肪基质干细胞体外向多巴胺能神经元诱导分化及分泌功能。方法:利用胶原酶消化法获得SD大鼠脂肪干细胞,体外培养至第3代时用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和抗坏血酸联合诱导作为实验组,以单纯加入体积分数5%血清为对照组。结果与结论:实验组诱导3d后,免疫荧光法和免疫组织化学法均可检测到诱导后的细胞表达酪氨酸羟化酶。实验组分化出多巴胺能神经元比例显著高于对照组(P<0.01)。ELISA法检测实验组连续诱导3d上清中有多巴胺分泌,诱导的第一二天中多巴胺浓度呈上升趋势,第3天有所下降。说明脂肪干细胞具有向多巴胺能神经元分化的能力。     

小胶质细胞对体外培养神经干细胞向胆碱能神经元分化的影响

背景:神经干细胞的定向分化与小胶质细胞的浓度有关,浓度倍数过小可能达不到应有效应,太大则会产生细胞毒性.目的:观察不同比例的小胶质细胞对体外培养的神经干细胞向胆碱能神经元方向分化的影响.方法:取新生24,48 h内Wistar大鼠用于神经干细胞与小胶质细胞的原代培养,免疫组化进行鉴定.神经干细胞与小胶质细胞共同接种于6孔板,接种密度分别为10∶1,4∶1,1∶1,1∶4,1∶10,每种密度设6孔,以单纯神经干细胞作为对照,共培养3,7,14 d,观察细胞的生长情况.结果与结论:原代培养的神经干细胞聚集成球状,悬浮生长,Nestin染色阳性,胞核不着色.小胶质细胞贴壁生长,折光性强,大部分细胞有短的突起呈分支状,小胶质细胞特异性标记抗体CD11b/c染色结果显示细胞纯度在80%以上.与单纯神经干细胞对照组相比,神经干细胞与小胶质细胞以10∶1,4∶1,1∶1,1∶4,1∶10接种密度共培养组ChAT阳性细胞数均明显升高.共培养组神经干细胞与小胶质细胞比例为4∶1时升高幅度显著高于其他接种密度 (P < 0.05),且在培养第7天时生长达到高峰.结果提示小胶质细胞可以促进神经干细胞向胆碱能神经元方向分化,神经干细胞与小胶质细胞4∶1比例共培养第7天时效果最佳.     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的:比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性,为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法:实验于2004-11/2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养,每3天换液1/2,每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中,补足神经干细胞分化培养基,继续培养7d,进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定,以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力,并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果:①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果:胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞,并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果:原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应,结合悬浮培养有神经球形成的现象,证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数、阳性率的比较:两组培养1,3,7,11,14,28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异(t=2.41～92.71,P<0.01或0.05)。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定:胚胎鼠及新生鼠的MAP2阳性细胞分别为(32.6±5.6)%,(30.7±6.7)%,抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为(47.5±9.4)%,(50.3±8.9)%,P均>0.05。结论:从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞,表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin,并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强,更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一股以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006—10／2007—03在重庆医科大学完成。材料：新生1～3d的Wistar大鼠全大脑。方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0．10胎牛血清的DMEM／F12培养液诱导其分化。主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经千细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、旱形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。     

软脑膜细胞诱导神经干细胞高比例分化为神经元的效应

目的：观察软脑膜细胞对神经干细胞分化的影响。方法：实验于2004年在上海体育学院运动科学系实验中心完成。从脑组织分别分离和培养软脑膜细胞和神经干细胞，并进行两种细胞的共培养，同时按照免疫细胞化学染色方法，观察和鉴别神经干细胞在软脑膜细胞提供的微环境下的分化状态。结果：自然分化条件下，微管相关蛋白-2ab阳性的神经元、胶质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和2，3-环核苷酸磷酸二酯酶阳性的寡突胶质细胞在神经干细胞后代中所占比例分别为（14．6&;#177;4．5）％，（11．3&;#177;3．8）％和（73．6&;#177;18．7）％。而在共培养条件下，神经元、星型胶质细胞和寡突胶质细胞在神经干细胞后代中所占比例分别为（40．5&;#177;15．8）％．（44．6&;#177;16．7）％和（15．3&;#177;4．1）％。结论：软脑膜细胞可诱导神经干细胞高比例分化为微管相关蛋白-2ab阳性的神经元。     

三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元

目的：观察三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经兀的能力。方法：实验于2004-10／2005—02在广州中医药大学神经解剖学实验室完成。选择40只SD大鼠，随机分为对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、龟板组与三甲复脉汤组，每组10只。龟板组与三甲复脉汤组每天给予龟板与三甲复脉汤口服液4mL灌胃1周，对照组及碱性成纤维细胞生长因子组则给予等体积蒸馏水灌胃1周。采用含药血清体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞，龟板组与三甲复脉汤组用含10μg／L碱性成纤维细胞生长因子的L—DME 2μL预处理24h后，再分别加入龟板、三甲复脉汤含药血清诱导。每次诱导时设有对照血清组与碱性成纤维细胞生长因子组（加入10μg／L碱性成纤维细胞生长因子2μL）。诱导后5h，12h，1d，3d，7d在倒置显微镜下观察细胞形态，免疫组化鉴定神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达。结果：在实验过程中共有2只动物死亡，进行了相应的补充，进入结果分析为40只，保持为4组，每组10只。①骨髓间充质干细胞受诱导向神经元分化的形态特征：骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、龟板与三甲复脉汤血清诱导5h后，部分细胞形态发生明显改变，胞体变小，胞质向核周收缩，由原来的梭形变成圆形，形成网络样结构。随着诱导时间延长，骨髓间质干细胞呈渐近性的向神经元样细胞转化，神经样细胞增多。对照组未见有神经元样细胞出现。②骨髓间充质干细胞诱导后细胞的神经分化鉴定：神经元样细胞的胞体和突起神经丝蛋白染呈棕色，神经丝蛋白阳性细胞胶质纤维酸性蛋白染色为阴性。③骨髓间充质干细胞诱导后细胞的神经元样细胞数：诱导后12h，神经元样细胞阳性率达到高峰，碱性的成纤维细胞生长因子组、龟板组、三甲复脉汤组细胞的神经元样细胞数均高于对照组[（74&;#177;6），（75&;#177;6），（71&;#177;5），（6&;#177;1）个1；至第7天仍有神经元样细胞存活，其中以三甲复脉汤存活时间最长，高于碱性成纤维细胞生长因子组和龟板组[（21&;#177;3），（12&;#177;3），（15&;#177;2）个]。结论：三甲复脉汤含药血清可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元，而且能延长其表达。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的基因表达谱

目的：从基因水平了解黄芪在诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用途径。 方法：实验于2002-09／2005-06在广州医学院病理生理学教研室和解剖教研室完成。①间充质干细胞的定向诱导分化：实验组加入预诱导液（20mL／L天麻注射液含体积分数为0．1的胎牛血清的L-DMEM），对照组只换液不加天麻。24h后吸去预诱导液，实验组加入诱导液（100mL／L黄芪注射液不含胎牛血清的I广DMEM），诱导细胞分化1h，对照组换液为不含胎牛血清的L-DMEM。②细胞总RNA的提取。③间充质干细胞诱导分化过程中差异表达基因的筛选。 结果：①骨髓间充质干细胞及其诱导分化细胞：培养5～10代的细胞在黄芪诱导液中诱导1h后分化为神经元样细胞，免疫组织化学染色显、示巢蛋白阳性，神经元特异性烯醇酶阳性，胶质纤维酸性蛋白阴性。②两组细胞的总RNA：紫外分光光度检查其吸光度（A值），A60/A280为1．8～2．0；甲醛变性凝胶电泳显示28S，18S，5S3条带。③在9052个基因中，与对照组相比，实验组检测到有379个基因表达下调，其中下调倍数大于2倍的有19个；表达上调的基因共有151个，其中有7个基因的上调倍数大于2，包括bHLH，epiregulin，fibroblaatgrowthfactor9等基因。 结论：黄芪可有效地诱导骨髓间充质干细胞分化神经元，其作用过程涉及多种基因。     

远志总皂苷对神经干细胞向神经元分化的影响

目的:观察远志总皂苷对神经干细胞(NSCs)向神经元分化的影响.方法:分离、培养并鉴定新生大鼠海马区NSCs,分别添加终浓度5 μg/mL、20 μg/mL及100 μg/mL的远志总皂苷进行诱导1 d或3 d.免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.结果:原代与传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成悬浮...