人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA的分离与鉴定

目的 获得人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA序列,为进一步研究伴侣蛋白在蛋白质折叠中的功能提供理论依据。方法 采用“同源杂交筛选策略”,运用生物信息学方法结合PCR等分子生物实验技术,从人cD-NA文库中分离目的片段,并测序鉴定。结果 从人的睾丸组织cDNA文库中分离出一条新的cDNA片段,将它与计算机拼接的片段整合后,获得一全长为1935bp的序列,该序列含有一个长1680bp的的开放阅读框,编码535个氨基酸,并且在其3‘末端有典型的PolyA加尾信号。结论 基于从该cDNA推导的蛋白质与小鼠的CCTβ亚基氨基酸序列同源度性达97%,由这个新基因所编码的推导蛋白可能就是人的CCTβ亚基。     

人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA的分离与鉴定

目的获得人伴侣蛋白CCTβ亚基全长cDNA序列,为进一步研究伴侣蛋白在蛋白质折叠中的功能提供理论依据.方法采用“同源杂交筛选策略”,运用生物信息学方法结合PCR等分子生物学实验技术,从人cD-NA文库中分离目的片段,并测序鉴定.结果从人的睾丸组织cDNA文库中分离出一条新的cDNA片段,将它与计算机拼接的片段整合后,获得一全长为1935bp的序列,该序列含有一个长1680bp的开放阅读框,编码535个氨基酸,并且在其3'末端有典型的PolyA加尾信号.结论基于从该cDNA推导的蛋白质与小鼠的CCTβ亚基氨基酸序列同源度性达97%,由这个新基因所编码的推导蛋白可能就是人的CCTβ亚基.     

人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定

目的:利用基因工程技术克隆TRAIL基因全长cDNA,并构建其原核表达载体.方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了TRAIL,将其连接于克隆载体pMD18-T中,并通过酶切及测序鉴定载体构建的正确性.结果:应用RT-PCR技术和BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切成功获得1049 bp的目的片段,测序分析结果表明该基因序列与报道的TRAIL基因片段的序列完全相同.结论:成功克隆了TRAIL基因的cDNA全长,为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.     

人食管癌细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 构建人食管癌细胞cDNA噬菌体表达文库。方法 从食管癌细胞中提取总RNA,利用磁珠吸附法分离其中的mRNA,逆转录合成cDNA第一链,再通过碱基互补配对原则合成第二链,对双链cDNA进行末端修饰,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5′端,除去不合要求的cDNA片段,将符合要求的与载体（噬菌体T7 Select10-3b）连接,然后进行体外包装建成初步的cDNA文库,并对文库进行鉴定。结果 食管癌细胞cDNA原始表达文库的滴度为2.01×106 pfu/mL,重组率高达100%,插入片段的大小范围在300～1 500 bp之间。结论 本实验成功构建了人食管癌T7噬菌体展示cDNA表达文库,并经过了初步鉴定,为下一步利用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术（SEREX技术）鉴定食管癌相关抗原奠定基础。     

人表皮干细胞的分离和鉴定

目的　探索一种分离人表皮干细胞的新途径 ,为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法　以基底细胞作常规细胞培养 ;采用分类技术并结合表皮干细胞的特性 ;免疫细胞化学S P法鉴定。结果　用中性蛋白酶和胰酶消化可分离基底细胞 ,(1～2 )× 10 4/ml的基底细胞接种于以 3T3为滋养层的培养瓶内 ,以含EGF等因子的DMEM为培养液 ,2d后细胞开始增殖 ,一周许去除滋养层 ,10～ 12d可传代。异硫氰酸酯荧光素 (FITC)标记的基底细胞经流式细胞仪分选及IV型胶原 2 0min内的粘附后获得一些圆形、大小较一致的细胞。以鼠抗人K19的单抗为一抗 ,免疫细胞化学S P法呈棕黄色阳性反应 ,证实分离出的细胞为表皮干细胞。结论　通过荧光激活细胞分类和IV型胶原的粘附可分离出表皮干细胞 ,为组织工程皮肤的研究打下基础     

人脑神经干细胞的分离培养和鉴定

目的 探讨人脑神经干细胞的分离培养和鉴定方法。方法 采用无血清培养液从人胚胎脑皮质分离和培养神经干细胞，并应用免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向化潜能的鉴定。结果 鉴定表明从人胚胎脑皮质分离培养的细胞具有神经干细胞的特征，并可在体外增殖，经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。结论 从人胚胎脑皮质成功分离培养了神经干细胞，它是研究细胞诱导分化的良好模型。     

人羊膜成纤维细胞的分离和鉴定

目的：建立人羊膜成纤维细胞的体外培养方法,通过细胞的形态特征和免疫组织化学进行鉴定,从而获得人羊膜成纤维细胞,为后续的干细胞研究奠定基础。方法：从足月分娩人胎盘剥离羊膜,胰蛋白酶和胶原酶消化后分离人羊膜成纤维细胞,采用含表皮生长因子（EGF）的DMEM培养基进行培养。显微镜下观察细胞形态表现,采用HE染色和免疫组织化学染色分析细胞特征,采用流式细胞术（FCM）分析人羊膜成纤维细胞的纯度。结果：采用胰蛋白酶和胶原酶先后消化获得人羊膜成纤维细胞,显微镜下观察,细胞呈放射状或旋涡状生长。免疫组织化学染色,人羊膜成纤维细胞明显表达成纤维细胞标志物波形蛋白（Vimentin）,不同程度地表达S100钙结合蛋白A4（S100A4）,不表达上皮细胞标志物角蛋白19（CK19）。流式细胞术分析,人羊膜成纤维细胞的纯度为86.1%。结论：成功建立了人羊膜成纤维细胞分离和鉴定方法,获得的细胞具有成纤维细胞的特异标志和表型特征。     

表达人GM-CSF的K-562细胞株的构建及鉴定

粒-巨细胞集落刺激因子GM-CSF在肿瘤主动免疫治疗中的重要作用已经得到肯定,我们构建稳定表达GM-CSF的K-562细胞株,为肿瘤免疫治疗在临床上的广泛开展奠定基础。     

人胃粘膜上皮细胞分离,培养和鉴定

人胃粘膜上皮细胞分离、培养和鉴定Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｇａｓｔｒｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ￥／／刘卫，房殿春，梁后杰，刘为纹（重庆第三军医大学附属西南医院消化内科）重庆，６３０...     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法.方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附、分离和角质细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照.结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达.结论:运用Ⅳ型胶原黏附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养.     

腹泻病人空肠弯曲菌的分离和鉴定

胎儿弯曲菌空肠亚种(Campylobacter fetus subspecies jejuni)简称空肠弯曲菌,是一种世界范围的动物性致病菌,可经多种途径传染至人。1972年Dekeyer氏等首先在比利时从腹泻病人大便中分离出空肠弯曲菌,证实了人类的感染。1982年我们检查了本院附属医院肠道门诊腹泻病人73例,按吉崎悦郎、Chester氏及Bergey氏细菌鉴定手册(1974年版)等资料进行分离、鉴定,确定了三株空肠弯曲菌。     

人载脂蛋白H的分离、纯化和鉴定

 目的 探索一种相对简便而高效的方法,从人血浆中分离、纯化载脂蛋白H。方法 用高氯酸预处理血浆,以离子交换色谱和亲和色谱相结合的方法进行蛋白质的分离和纯化。用SDS-聚丙烯凝胶电泳和Western blot对纯化产品进行鉴定。用BCA蛋白质定量测定试剂盒测定获得载脂蛋白H的量。结果 连续分离、纯化3次,每次获得的产品纯度均大于98%,且经Western blot分析均能与抗β₂-Glycoprotein I单克隆抗体呈阳性反应。3次纯化共获得apoH 12.56 mg,平均21 mg/L。结论 本方法重复性好、可靠性高,较传统方法更为简便和经济。     

人胚神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：从流产人胚前脑中分离培养人胚神经干细胞。方法：神经干细胞具有自我复制和多向分化潜能。本实验利用神经干细胞特定的培养增殖培养体系分离纯化人胚神经干细胞,并对分离得到的神经干细胞的分子标记及分化潜能进行鉴定。结果：从8~10周龄流产人胚胎分离得到了神经干细胞,它能表达神经干细胞特异性抗原nestin,并能在体外诱导分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论：在人胚中枢神经系统中存在神经干细胞,并能够在体外扩增,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

人子宫颈黏液抗菌多肽的分离和鉴定

目的　从人的子宫颈黏液分离和鉴定新抗菌多肽,探讨子宫颈黏液抗菌机制。方法　用5%乙酸提取人子宫颈黏液可溶物,应用电泳凝胶抗菌蛋白分析法分析其抗菌蛋白,制备酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳及反相高效液相色谱分离纯化抗菌多肽。凝胶琼脂糖弥散法抗菌检测抗菌活性。纯化的抗菌多肽进行氮端氨基酸序列测定,根据其序列设计简并引物,利用简并聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA。通过BLAST硷基比对程序分析比较与已知蛋白的同源性。进一步应用常规基因重组技术构建其原核表达质和制备重组多肽。采用最小抑菌浓度和最小杀菌浓度检测重组多肽的抗菌效能。结果　从子宫颈黏液中分离纯化到一个具抗菌活性的多肽,通过蛋白测序、简并PCR及BLAST等方法鉴定该蛋白为HMGN2高游动性蛋白。制备获得重组HMGN2多肽,重组HMGN2抗大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度分别为10 .42μg/ml±3. 13μg/ml和27. 78μg/ml±8 .33μg/ml,与人中性粒细胞防御素相当;最小杀菌浓度分别为20 .83μg/ml±6 .25μg/ml和55 .56μg/ml±16 .67μg/ml。结论　除已知的抗菌肽外,HMGN2亦可能是宫颈黏液含有的抗感染效应分子之一。     

人外泌汗腺的分离培养和鉴定

我们探讨了人皮肤汗腺细胞的分离及体外培养方法,观察总结了汗腺细胞体外培养的生长特征,以获得稳定生长的正常皮肤汗腺细胞,为体外研究汗腺奠定基础。     

人胃癌混合组织cDNA文库的快速构建和鉴定

目的 :构建人胃癌混合组织cDNA文库 ,筛选克隆胃癌相关基因。方法 :以纯化的 poly(A) + RNA为模板 ,含NotⅠ切点的Oligo (dT) 15为引物 ,利用改良的cDNA快速合成方法 ,反转录合成cDNA第一、二链 ,连接连接子 ,经层析柱纯化去除小片段和多余连接子后 ,重组于噬菌体载体 ,行体外包装后以大肠杆菌Y10 90行滴度测试及扩增后 ,建成cDNA文库。结果 :构建的cDNA文库 ,含 3 2× 10 6重组子 ,重组率为 96 %。扩增后文库的滴度达1 2× 10 12 pfu/L。 结论 :成功地构建了人胃癌混合组织cDNA文库 ,为进一步筛选克隆胃癌的相关癌基因或抑癌基因奠定了基础     

人胎肝cDNA文库构建及鉴定

从人胎肝组织提取总ＲＮＡ并纯化出ｍＲＮＡ，经反转录合成第一、二链ｃＤＮＡ，去除小于２００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，与去磷酸化的λｇｔ１１噬菌体长、短臂连接，体外包装后感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，成功构建含４．２×１０８重组子的人胎肝ｃＤＮＡ表达文库，重组子平均外源插入片段约１．５ｋｂ，适合用于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

人泛素结合酶cDNA的分离与克隆

目的 分离、克隆人泛素结合酶基因,并初步研究其组织表达谱。方法 根据与鼠泛素结合酶有较高一致性的人表达序列标签（ＥＳＴ）设计筛库引物,筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库,采用生物信息学方法分析筛选到的阳性克隆;设计控针,应用人多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 从文库中筛选到两个互为剪接异构体的长度分别为１ ４７１和１ ３１５ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆,其开放读码分别编码１４７和１０９个氨基酸,与鼠、果蝇、线虫