重组胸腺素α1 pMAL-C2x- Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1(Tα1)的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白(MBP-Tα1),采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白表达影响因素分析

目的优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导温度为37℃,诱导表达6.0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以0.1mmol/L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0.6mmol/L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4.0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Western blotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0.3mmol/L时,融合蛋白GST-NS1在IPTG诱导5.0h时的表达量最高,达28.5%;当IPTG诱导浓度为0.6mmol/L,在37℃诱导表达4.0h时,融合蛋白的表达量可达27.9%。选用优化的表达条件,IPTG 0.6mmol/L,37℃诱导表达4.0h,融合蛋白的表达量最高可达33.2%。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25.1%。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。     

溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌

目的 建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺.方法 以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS Bioflo Ⅳ 20 L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化.结果 保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2 mmol/L IPTG诱导5 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70 g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上.结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.     

重组人干扰素α—2b工程菌的培养与发酵条件的优化研究

用均匀设计法对重组人干扰素α-2b基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,确定摇瓶培养基组成为：每升含蛋白胨10 g、葡萄糖6 g、酵母粉5 g、Na2HPO4　6　g、KH2PO4　2　g、NH4Cl　0.8　g、NaCl　4　g、CaCl2　0.01　g、MgSO4　0.2　g,发酵表达条件为：pH　6.9,温度37℃,IPTG诱导后表达时间为5　h左右,装料量为20%。三批小试结果为：湿菌体平均产率18　g/L,生物活性3.93×108　IU/L。发酵罐三批中试放大试验,湿菌体平均产率为29　g/L,生物活性为6.68×108　IU/L发酵液。     

H5N1亚型禽流感病毒NSl蛋白表达影响因素分析

目的 优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol／L,诱导温度为37℃,诱导表达6．0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以o．1mm01／L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0。6mmo1／L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4．0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Westernblotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0。3mmol／L时,融合蛋白GST-NSl在IPTG诱导5．0h时的表达量最高,达28．5％;当IPTG诱导浓度为0。6ram01／L,在37℃诱导表达4。0h时,融合蛋白的表达量可达27．9％。选用优化的表达条件,IPTG0．6mmo1／L,37℃诱导表达4．0h,融合蛋白的表达量最高可达33．2％。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25．1％。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

肝癌相关抗原SMP-30基因工程菌培养条件的优化

目的:对重组人肝癌相关抗原SMP-30基因工程菌的培养条件进行研究,确定最佳培养方案以提高基因工程蛋白表达产量.方法:通过SDS-PAGE蛋白质电泳和电泳图谱扫描来分析诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导时间长短、培养温度和培养基成分对基因工程菌TB1表达肝癌相关抗原SMP-30的影响.结果:当工程菌培养条件合适,即在吸光度值A600为0.5左右时加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L,30℃培养7 h,其表达的SMP-30融合蛋白可占细体总蛋白量的46.1%.将工程菌培养温度从37℃降到30℃时,表达蛋白质的可溶性部分可提高10%～15%.结论:通过对重组人肝癌相关抗原SMP-30基因工程菌的培养条件进行优化,获得较满意的应用工程菌表达肝癌相关抗原SMP-30的培养条件,为基因工程下游技术奠定了基础.     

重组SOD的摇瓶发酵条件研究

目的:对含PTD-SOD重组质粒的工程菌进行诱导表达。方法:通过SOD活性和SDS-PAGE电泳分析,考察了诱导时间和诱导剂浓度对PTD-SOD表达量的影响。同时考察了诱导温度对产物表达形式的影响。结果:表达条件为IPTG浓度0.5mM,诱导时间4h,诱导温度20℃。结论:在上述条件下重组SOD在摇瓶中的表达效果最好。     

正交试验设计优化重组蛋白溶细胞毒素的表达

目的:对创伤弧菌溶细胞毒素融合蛋白表达条件进行优化,从而获得高效稳定的溶细胞毒素(Vibrio vulnificus Hemolysin,VVH)原核表达系统。方法:质粒pGEX-4T-1-vvh转化E.coli BL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果:直观分析表明诱导时间的R值最大,其次为摇菌转速和诱导剂IPTG浓度,诱导温度的R值最小;方差分析表明诱导时间的P<0.05,而转速、温度及IPTG浓度的P均>0.05。结论:诱导时间为主要因素(其为4h,表达水平最高),其次为摇菌转速、诱导剂IPTG浓度和诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数为250r/min、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下,溶细胞毒素的表达量达到了55.31%。     

肝癌相关抗原kinectin基因片断的重组表达

目的:研究肝癌相关抗原kinectin基因片断的体外重组表达方法,为该抗原的生产奠定基础.方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原kinectin的基因片断,将目的基因插入表达载体pMAL-C2上麦芽糖结合蛋白(MBP)基因下游的多克隆位点,转化DH5α菌.通过蓝白斑筛选、PCR鉴定、内切酶鉴定及DNA测序筛出正确的重组子,并用其转化TB1菌.用IPTG对重组的TB1工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定.结果:kinectin基因片断正确插入pMAL-C2载体的多克隆位点,用IPTG对工程菌进行诱导,可见目的蛋白条带出现.结论:pMAL-C2载体可用于对肝癌相关抗原kinectin的体外基因重组表达.     

诱导重组人生长激素工程菌高效表达的研究

目的 筛选诱导重组人生长激素（rhGH)工程菌高效表达的最佳条件，为中试及工业化发酵培养提供依据。方法 质粒PBV－GH转化4种不同宿主菌，比较6种不同培养基在不同pH值、氧含量改变情况下，rhGH工程菌的生长和表达差异，筛选并确定最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件。结果 ①E.coli DH5α为最适宿主菌；②TB培养基为最佳培养基；③培养基pH7.5-7.8有利于目的蛋白的表达。④在半对数生长期（培养4－5h)迅速升温，且菌密度控制在D600nm3.0之前诱导可获得较高的重组蛋白表达量，rhGH表达量占菌体总蛋白的40％。发酵时间为10h。结论 E.coli DH5α为rhGH高效表达的最适工程菌，E.coli DH5α/PBV-GH在pH7.5-7.8的TB培养基中发酵生长10h，可使菌量最佳扩增，目的产物rhGH表达效率最高。     

幽门螺杆菌Omp22-HpaA融合基因工程菌蛋白的表达

目的:优化幽门螺杆菌Omp22-HpaA基因工程菌pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达条件,并对其表达产物进行纯化和鉴定.方法:在不同诱导时机、不同诱导剂(IPTG)浓度和不同诱导时间条件下诱导pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,采用Amyloss树脂预装柱对可溶性Omp22-HpaA蛋白进行分离、纯化,对纯化后的蛋白行Western blot分析.结果:工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.4 mmol/L)诱导7 h,目的蛋白Omp22-HpaA表达量达到菌体总蛋白的20%以上.经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性.结论:建立了从pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1可溶性表达产物中纯化较高纯度Omp22-HpaA融合蛋白的方法.     

重组复合干扰素基因工程菌发酵培养条件的研究

目的:研究表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coliDH5α(pBV220/con-IFN)的发酵条件。方法:在摇瓶实验中,采用正交设计法和均匀设计法确定较佳培养基组分;使用20 L发酵罐进行补料分批发酵实验,研究影响菌体生长和con-IFN表达的因素(如溶氧、补料、温度和诱导时间)。结果:发酵培养基配方为蛋白胨10 g/L,酵母膏7.5 g/L,甘油0.5%,Na2HPO4.12H2O 20.13 g/L,KH2PO410.37 g/L,NaCl 9.31 g/L。确定了高密度发酵工艺,即优化的发酵培养基,初始pH7.2,接种量5%,溶氧15%,先经35℃培养4 h,后降温至30℃培养2 h,再以42℃诱导7 h,诱导的同时补料酵母膏0.5%。在此条件下,发酵液可得15.2 g/L湿菌体,con-IFN的表达量占菌体总蛋白的49.60%,每毫升发酵液的抗病毒活性为9.69×108IU。结论:获得了较满意的优化培养基配方和发酵条件,为下游纯化和进一步大规模生产奠定了基础。     

茯苓液体发酵条件的研究

通过摇瓶培养实验,对茯苓生长曲线进行了初步摸索,并进一步对茯苓液体发酵的最适培养基和培养条件进行了初步探讨.茯苓液体发酵的最适发酵培养基为:葡萄糖30 g,酵母浸膏3.9 g,蛋白胨5.1 g,K2HP04 1 g,M gS04.7H2O 0.5 g,水1L.茯苓液体发酵的最适培养条件为:培养温度26℃,摇瓶装量60mL(250 mi三角瓶),转速150 r/min,培养基初始pH值5.5,液体菌种茵龄2天,液体菌种接种量6%,摇瓶培养时间7天.     

工程菌BL21/pET-11 c/hIL-2-mGM-CSF培养条件的优化

目的 优化BL21／pET-11 c／hIL-2-mGM-CSF的培养条件以提高目的蛋白的表达量。方法采用拉丁方试验设计方法进行培养基、诱导温度和IPTG使用浓度的综合比较试验,对电泳结果进行扫描后作统计分析,并对该试验所推导出的培养条件进行验证。以最佳的培养条件进行连续3次扩大培养,将其与常规培养条件进行比较。结果采用高浓度肉汤培养得到的蛋白相对表达量优于2xYT和LB培养基。42℃诱导与37℃诱导相比能显著提高蛋白表达量．而低至0．3mmol／L的IPTG可得到优于1．0mmol／L所能诱导得到的蛋白表达量。统计学分析表明优化的培养条件与常规培养条件相比能显著提高目的蛋白的相对表达量。扩大培养时,采用最佳的培养条件培养,蛋白的相对表达量比优化之前提高了5倍．表达量达到菌体总蛋白的29％以上。结论通过改良方法培养工程菌BL21／pET．11c／hIL-2-mGM-CSF,hIL-2-mGM-CSF蛋白以较高的水平表达,为下一步的蛋白纯化和功能分析奠定了基础。     

幽门螺杆菌hpaA基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及其活性鉴定

目的:优化幽门螺杆菌hpaA基因工程菌(pMAL-c2X-hpaA-TB1)的表达条件,并对其表达产物进行纯化和免疫活性鉴定.方法:通过诱导表达实验了解不同诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间对蛋白表达量的影响, 并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性HpaA蛋白进行分离、纯化;对纯化后蛋白做Western blot实验鉴定免疫活性.结果:该工程菌培养2 h时加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mmol/L进行诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的30%以上;经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫活性.结论:建立了从TB1(pMAL-c2X-hpaA)可溶性表达产物中纯化高纯度rHpaA融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌发酵、高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

幽门螺杆菌1pp20基因在大肠杆菌TB1中诱导表达方法的研究

目的 :研究影响幽门螺杆菌lpp2 0基因在大肠杆菌TB1中表达的因素 ,探索高效表达的条件 ,为幽门螺杆菌疫苗抗原的纯化和生产奠定基础。方法 :用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp2 0基因片段 ,将目的基因插入的表达载体pMAL c2X中 ,用重组质粒转化大肠杆菌 (E .coliTB1)。采用不同的诱导时间、IPTG浓度和诱导温度进行诱导表达 ,应用SDS PAGE方法对表达产物进行分析。结果 :在诱导 1～ 4h之间 ,融合蛋白的表达量变化较为显著 ,而 4～ 8h之间则无显著变化 ;IPTG终浓度低于 0 .2mmol/L或高于3 .2mmol/L均能显著减少融合蛋白的表达量 (P <0 .0 5 ) ,而IPTG终浓度在 0 .4～ 2 .4mmol/L之间时 ,对融合蛋白的表达量并无显著影响 ;诱导温度在 3 0℃～ 40℃之间变化对融合蛋白的表达量无显著影响 ,超出此范围可使表达量显著减少 (P <0 .0 5 ) ;在优化诱导条件后 ,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白的 3 4%。结论 :通过调整诱导时间、IPTG浓度和诱导温度 ,lpp2 0基因与载体pMAL c2X的重组质粒在E .coliTB1中能够高效表达。     

分泌型重组铜绿假单胞菌外毒素A基因工程菌的发酵研究

目的：优化重组铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)基因工程菌的发酵条件，实现PEA的高效表达。方法：构建PEA的原核分泌型基因工程菌，利用摇瓶发酵研究PEA工程菌的最优表达条件，并放大至3．75L发酵罐水平。结果：摇瓶发酵的最优培养条件为温度30℃，摇床转速160r／min，在含2g／L葡萄糖的LB培养液中培养至A600≈2．5时，以终浓度为100μmol／L的异丙基硫基半乳糖(IPTG)诱导表达5h。3．75L发酵罐发酵与摇瓶发酵相比，发酵周期缩短了约三分之一，PEA表达水平接近摇瓶中发酵水平，目标蛋白表达率达到了26．6％。结论：利用摇瓶最优表达条件，较好地实现了重组PEA从摇瓶到发酵罐的放大。     

人α2a干扰素酵母工程菌高产培养条件的研究

研究了摇瓶培养条件对人α2 a干扰素酵母工程菌生长及表达的影响 ,结果表明 ,当基础料中腺嘌呤含量为 2 0 μg/m L,在发酵进行至 1 2 h时再加入 2 0 μg/m L腺嘌呤时 ,IFN- α2 a生物活性及比活分别达到 7.3× 1 0 6IU/m L及 6.77× 1 0 7IU/mg。发酵过程中后期补入适量萄萄糖 ,且维持低糖水平 ,有利表达。维持总碳源含量不变 ,使培养基中葡萄糖与蔗糖的比例为 1∶ 0 .1 ,结果 IFN-α2 a生物活性及比活分别比对照增加了一倍以上。在发酵进行至 1 2 h时 ,加入 2 g/L谷氨酸 ,IFN-α2 a生物活性及比活分别比对照提高了 1 .76倍及 1 .94倍 ,而添加 0 .2 5～ 1 .0 g/L赖氨酸也能显著提高表达水平。培养基初始 p H对产物表达有较大影响 ,初始 p H为 6.5时 ,对表达最有利。利用上述摇瓶培养优化条件 ,在 2 .6L生物反应器中进行补料分批培养 ,人 α2 a干扰素生物活性达到 1 .3×1 0 7IU/m L ,为原工艺的 3倍。     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白基因工程菌的发酵条件研究

目的研究呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）G蛋白基因工程菌的发酵工艺。方法通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件和表达条件，以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件，对发酵丁艺进行改良优化。结果确定了RSVG蛋白基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合：在LB＋葡萄糖的培养基中，搅拌速度为200r／min，培养温度为37℃，pH值为7．0，诱导时温度为25℃，IPTG浓度为0．01mmol／L，优化后T程菌菌体的产量可以达到39．20g／L，目的蛋白表达率平均为18．1％。结论建立了稳定高效的重组RSVGT程菌发酵工艺。