人副流感病毒HPIV多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立快速检测人副流感病毒的多重PCR方法。方法通过查阅文献获取副流感病毒的PCR引物序列,并利用分子生物学软件对其进行评估,同时设计合成半巢式PCR引物。提取分离病毒的总RNA,以RNA抽提物为模板,一步法一次反转录扩增HPIV-1,2,3,4等4种型别的副流感病毒。以多重RT-PCR产物作为模板,用半巢式PCR进一步扩增确认。结果利用多重RT-PCR方法一次扩增出人副流感病毒的4个不同型别,条带大小分别是317、507、189和451bp,与目的片段大小一致;半巢式PCR扩增出相应的特异条带,条带大小分别是261、340、145和390bp,扩增结果与目的片段大小一致。结论人副流感病毒多重RT-PCR快速检测方法已初步建立。     

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的：建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的H基因为模板设计的3对引物能特异性地扩增出942bp,1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1，甲3和乙型流感病毒有稳定对应的关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。结论：多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。     

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒HA基因的HA1片段,得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的HA基因的HA1片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物,用多重逆转聚合酶链反应能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段,它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒HA基因的HA1片段,根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感疾病。结论 多重逆转聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。     

应用多重PCR技术快速鉴定登革病毒

目的建立一套应用多重PCR技术快速分型鉴定4种血清型登革病毒的方法。方法用随机引物将1~4型登革病毒RNA逆转录成cDNA,再将4对登革病毒型特异性引物同时加到一个反应管中进行多重PCR扩增,根据扩增片段的大小判断血清型,并用2004年收集的登革热病人血清标本验证新建立的方法。结果同时用4对登革病毒型特异引物进行多重PCR,1~4型登革病毒标准毒株相应扩增的片段大小分别为391、319、216和152bp,与预期的扩增片段大小相符。2004年4份登革热病人血清标本扩增的片段大小均为391bp,属1型登革病毒。结论新建立的方法是一种特异、快速的登革病毒分型鉴定方法。     

巢式PCR快速检测炭疽芽孢杆菌

目的：快速简便地检测炭疽芽孢杆菌。方法：细菌培养物经反复冻融，SDS，蛋白酶K和煮沸处理后，作为PCR模板，根据炭疽芽孢杆菌质粒pX01中水肿因子（EF）基因设计两对引物，采用巢式PCR（nestedPCR)扩增目的基因，结果：从炭疽芽孢杆菌模板中成功扩增出1247bp的特异片段，而未在炭疽芽孢杆菌无毒株，蜡样芽孢杆菌和枯草杆菌模板中扩增出相应条带；第一次扩增能检出的最低细菌量是10^3拷贝；经再次巢式PCR，扩增出208bp的特异片段，最低检出的细菌数为10个拷贝，敏感性提高了100倍。结论：巢式PCR是一种快速，特异，敏感的检测炭疽芽孢杆菌的方法。     

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT—PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株（NGC）全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物，在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列，下游引物中加入Cla Ⅰ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT—PCR法扩增出约11kb基因片段，经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT—PCR技术，获得了登革2型病毒NGC株全长基因组，为进一步构建感染性克隆打下基础。     

常见深部念珠菌感染快速基因诊断

目的 研究快速、准确的常见病原念珠菌基因诊断方法，为临床深部念珠菌感染的分子诊断奠定基础。方法收集常见深部念珠菌感染临床株，应用多重聚合酶链反应(PCIR)技术扩增念珠菌rDNA的内部转录间隔区ITS1～ITS2，根据PCR产物片段的大小进行快速基因鉴定。结果依据多重PCR电泳图谱将53株常见医院感染念珠菌分为5型：(1)热带念珠菌14株，单一条带，大小约350bp；(2)白色念珠菌25株，2条带，大小约150bp和550bp；(3)光滑念珠菌8株，单一条带，大小约900bp；(4)克柔念珠菌5株，单一条带，大小约550bp；(5)乳酒念珠菌1株，单一条带，大小约700 bp。常见病原菌经PCR扩增均无产物。结论快速多重引物PCR诊断结果与常规生化鉴定一致，检出率100％，无假阳性。此方法简单、快速灵敏、特异性高、重复性好，有助于临床对真菌的早期快速诊断。     

分子生物学方法在儿童流行性感冒监测中的应用

目的：建立一种能够快速，特异，有效地直接从临床标本中检测流行感冒（流感）病毒并进行病毒型和亚型鉴别的方法，同时了解近年来北京地区A3型流感病毒因凝素重链（HA1）区基因的变异特点。方法：根据编码A、B型流感病毒膜蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物，用于同一逆转录（RT）－PCR反应中（多重RT－PCR），根据A、B型毒株扩增产物的大小（分别为506bp和261bp）鉴别A、B型流感病毒，另根据编码A1和A3型流感病毒糖蛋白HA基因的核苷酸序列设计两对引物，与B型M基因基因引物用同一RT－PCR反应中，可区分A1、A3或B型病毒HA基因和B型病毒M基因又设计了3对引物作为外侧引物，进行巢式－PCR反应。根据第二次PCR的扩增产物在1．2％的琼脂糖凝胶电泳中的大小即可确定型别。经PCR扩增1996－2002年间分离的北京地区A3型流感病毒株HA1区基因，测序并进行序列分析，结果：用上述多重RT－PCR鉴定流感病毒分离株156株，与血凝抑制试验阳性符合率为100％，用多重巢式－PCR检测92份已经病毒分离确定为流感的儿科临床呼吸道标本，与病毒分离和血凝抑制试验阳性符合率分别为76．9％（A1型）、57．1％（A3型）、86．5％（B型），对5株1996－2002年间A3间分离株HA1区基因序列分析结果显示，不同年份的分离株HA1区基因具有较高的核苷酸和氨基酸同源性，而且年份越近的毒株之间同生越测。为流感监测提供更加快速的新方法，北京地区A3型流感毒分离株HA1区基因持续不断地发生点突变，糖基化位点不断增多，可能是导致其抗原漂移的原因。     

RT-PCR快速检测腮腺炎病毒

目的：建立腮腺炎病毒的核酸快速诊断技术。方法：在腮腺炎病毒核蛋白基因（NP）的保守区域设计一对半引物，采用逆转录聚合酶链（RT-PCR）和半巢式PCR方法扩增腮腺炎病毒特异性核酸片段。结果：该方法能特异性地扩增腮腺炎病毒357bp和232bp的核酸片段，而对麻疹、风疹和流感病毒无交叉反应。检测腮腺炎病毒的灵敏度，1次PCR可检测出10CCID50，2次PCR反应可达0.1CCID50。采用该方法从流行性腮腺炎患含漱液标本中能直接检出腮腺炎病毒核酸条带。结论：该方法能特异、敏感地检测临床标本中腮腺炎病毒，是快速诊断腮腺炎病毒感染的理想方法。     

逆转录聚合酶链反应用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应系统,用于检测恶性疟原虫感染。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,分别采用RT－PCR技术和PCR技术进行检测恶性疟原虫血样并比较两才检测的敏感性。结果 从培养的恶性疟原血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。检测系统初步显示可检出恶性疟血样中0．34个疟原虫所含的RNA模板。以RNA为检测对象的RT－PCR肉眼可见条带的检测水平较以DNA为检测对象的PCR扩增高。结论 RT－PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,有一定的应用价值。     

北京地区肺炎病例呼吸道病毒及肺炎支原体感染调查

目的:调查北京地区肺炎病例中肺炎支原体及呼吸道病毒感染的病原学现况,探讨不同年龄组、不同月份病原学检出情况及其流行病学意义。方法:采用实时荧光PCR法及多重RT-PCR法,对501份呼吸道样本同时检测9种常见呼吸道病毒及肺炎支原体。结果:阳性检出率为40.32%,肺炎支原体、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒为主要病原体;不同年龄组的病原体检出阳性率不同;部分病原体有一定的季节分布规律。结论:肺炎支原体、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒为北京地区肺炎病例感染主要致病原,随年龄不同、流行季节不同而有一定的流行规律。     

Human parainfluenza type 4 infections, Canada

During the fall/winter season of 2004–05, we found 9 respiratory specimens positive for human parainfluenza virus type 4 (HPIV-4) in our laboratory (43% of all HPIVs) from patients with mild to moderate respiratory illnesses. Sequencing studies identified 8 different HPIV-4A strains and 1 HPIV-4B strain.     

巢式多重聚合酶链反应在腺病毒检测及分型中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的腺病毒检测及分型方法。方法根据编码腺病毒六邻体基因的核苷酸序列设计一对外引物（即通用引物），扩增产物为1278bp；再分别设计针对腺病毒六邻体基因3、7、11和21型特异性序列的4对内引物，扩增产物分别为502、311、880和237bp。应用多重巢式聚合酶链反应（nest—PCR）技术将这4对引物用于同一聚合酶链反应管中，根据扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上的大小，即可鉴别所测毒株的型别。结果3、7、11和21型腺病毒标准株和分离株分别产生预期的特异性扩增片段，与其他常见的呼吸道病毒等无交叉反应。118份经病毒分离和／或间接免疫荧光法确定为腺病毒阳性的急性呼吸道感染患儿临床标本中，腺病毒3型占64．4％（76／118），7型占31．4％（37／118），11型占2．5％（3／118），未检测到21型；2份病毒分离和间接免疫荧光均为腺病毒阳性的标本中，用该方法未能鉴定出型别，可能是3、7、11、21型以外的腺病毒，占1．7％（2／118）。33份经病毒分离和／或间接免疫荧光法均未检测到腺病毒的标本中，有3份为PCR阳性（包括1份7型，2份3型）。结论该方法鉴别3、7、11、21型腺病毒具有快速、简便、特异等特点，适用于腺病毒型别鉴定，可以为急性呼吸道感染的临床或群体公共卫生事件提供病原学诊断依据。     

应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法

目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法。方法利用Primer Premier5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性。结果应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142 bp、293 bp、377 bp、630 bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5 000 PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应。结论应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测。     

应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究

目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的最低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.     

多重PCR技术检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒方法的建立与应用

目的建立多重PCR技术检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒的方法,以便及时监测并快速诊断急性病毒性呼吸道感染。方法参照NCBI数据库病毒核酸序列设计多重PCR引物,优化反应条件,并对392份儿童呼吸道标本进行检测,验证多重PCR反应的敏感度及特异性。结果采用多重PCR引物对人博卡病毒(h BOV)、KI多瘤病毒(KI)、腺病毒(Ad V)、WU多瘤病毒(WUPy V)、人细小病毒B19(HPVB19)5种DNA病毒进行扩增,分别获得404、324、248、77、128 bp片段,均无非特异性扩增条带,与设计相符;392份儿童呼吸道标本多重PCR扩增出190阳性标本,阳性率为48.46%(190/392),6个月~3岁以内婴幼儿阳性率70.00%(112/160)为最高。结论本研究初步建立了应用多重PCR技术快速检测儿童呼吸道标本中DNA病毒敏感性、特异性好的方法,6个月~3岁以内婴幼儿检出率高。