人骨髓基质干细胞的分子表型特征及微环境依赖向内皮分化的能力

目的 :探讨人骨髓基质干细胞的分子表型特征及与成熟内皮共培养时向内皮分化的能力。方法 :采用密度梯度离心法分离培养人骨髓基质干细胞 ,用荧光激活细胞分选法分析其CD34、CD10 5和CD16 6表达率 ,用免疫荧光细胞化学法观察与成熟兔主动脉内皮共培养的人骨髓基质干细胞Flk -1和vWF蛋白表达 ,并分析anti VEGF抗体对骨髓基质干细胞Flk -1表达的影响。结果 :分离培养的骨髓基质干细胞CD34表达率为 (4 .16± 0 . 16 ) % ,与阴性对照 (4. 0 6± 0 . 2 3) %相比无统计学差异 ,CD10 5表达率为(90 .2 0± 2 . 35 ) % ,CD16 6表达率为 (82. 30± 3. 2 2 ) % ,均明显高于阴性对照 (n =6 ,P <0 .0 5 ) ;与成熟内皮细胞共培养 5d时 ,vWF染色仍为阴性 ,但部分骨髓基质干细胞开始表达Flk -1;anti VEGF抗体呈浓度依赖地抑制Flk- 1阳性骨髓基质干细胞计数 (n =6 ,P <0 .0 5 )。结论 :与成熟内皮共培养的骨髓基质细胞具有微环境依赖向内皮细胞分化的能力。     

层黏连蛋白-整合素α6的相互作用对肝癌细胞黏附过程中表型变化的影响

目的:以整合素α6单抗阻断肝癌细胞与细胞外基质层黏连蛋白(laminin,LN)的相互作用,观察肝细胞肝癌在与细胞外基质发生黏附之后所引起的细胞表型的变化.方法:以LN作为细胞外基质,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)为对照基质,常规培养人肝细胞癌细胞系BEL-7402细胞:以整合素α6单抗作用后检测细胞黏附于LN之后的变化:免疫细胞化学检测BEL-7402细胞整合素α6的表达;酸性磷酸酶法检测细胞在不同基质上的黏附率;采用BrdU试剂盒检测细胞的增殖变化;Boyden小室检测细胞迁移及侵袭能力;明胶酶谱法检测细胞基质金属蛋白酶的分泌.结果:免疫细胞化学染色显示BEL-7402细胞胞膜及胞质有整合素α6的强染色.细胞在LN基质上的黏附率较对照组明显增加,而以整合素α6抗体作用后细胞黏附率明显下降(104.4%vs 187.2%,P＜0.05).经整合素α6抗体阻断后,BEL-7402细胞侵袭能力明显下降(穿膜细胞数:88.7±9.9vs 103.2±16.5,P＜0.01).明胶酶谱法检测发现细胞黏附于细胞外基质后基质金属蛋白酶种类及分泌量明显增加,加入合素α6抗体后基质金属蛋白酶的分泌明显受到抑制.结论:阻断整合素α6与细胞外基质LN的相互作用可能会降低肿瘤细胞的转移潜能.     

整合素α6在肝细胞癌黏附过程中诱导PI3K及MAPK双信号传导通路

目的: 探讨肝细胞癌与细胞外基质发生黏附过程中所引起的信号转导通路的变化. 方法: LN作为细胞外基质, BSA作为对照基质, 常规培养人肝细胞癌细胞系BEL-7402细胞; 以整合素alpha6单抗作用后检测细胞黏附于LN之后的变化以及所诱导的信号传导通路. Boyden小室检测细胞迁移及侵袭能力; Western blot分析检测细胞ERK磷酸化, RT-PCR方法检测PI3K及Akt基因mRNA表达的变化. 结果: 细胞在不同基质上发生黏附的时间为30 min-1 h, 但没有明显差异. 细胞在LN基质上的黏附率为187.2%, 而以整合素alpha6抗体作用后黏附率为104.4%, 细胞黏附率明显下降(P<0.05). BEL-7402细胞穿过Matrigel发生侵袭的细胞数分别为每高倍视野103.2±16.5个, 抗整合素alpha6单抗10 mg/L作用后为88.7±9.9个, 有显著性差异(P<0.01); BEL-7402细胞PI3K及Akt的表达在黏附于细胞外基质后明显增加, 而且ERK 磷酸化明显增加, 整合素alpha6抗体可以部分降低表达及磷酸化. 结论: 细胞在黏附过程中有PI3K及ERK两条传导信号分子参与, 并与整合素alpha6及LN相关.     

血管紧张素Ⅱ对大鼠HSC合成PAI-I的影响及NO的干预作用

目的:明确血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠肝星形细胞(HSC)细胞外基质降解的影响以及一氧化氮(NO)对其的干预作用.方法:采用原位酶灌注法分离培养HSC,发色底物法测定纤溶酶原激活物抑制物-I(PAI-I)活性,硝酸还原酶法测定NO浓度;采用半定量RT-PCR法检测PAI-I mRNA的表达.结果:AngⅡ能剂量依赖性地促进HSC合成和释放PAI-I,NO、依那普利和氯沙坦均能减弱这种作用.结论:AngⅡ能通过Ⅰ型受体抑制细胞外基质降解,NO可以拮抗这种作用.促进细胞外基质代谢是依那普利和氯沙坦抑制肝纤维化的机制之一.     

细胞因子对白血病抑制因子和IL-6在骨髓基质细胞表达的调节

目的 :研究白细胞介素 1(IL 1)、TNF α、白细胞介素 4 (IL 4 )对骨髓基质细胞白血病抑制因子 (LIF)和白细胞介素 6 (IL 6 )表达的调节。方法 :用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定各细胞因子作用下的LIF与IL 6水平 ,用逆转录 聚合酶链反应 (PT PCR)测定各细胞因子作用下的LIF与IL 6转逆子水平。结果 :在IL 1、TNF α作用下LIF与IL 6水平明显升高 (P <0 .0 5 ) ,IL 4作用下IL 6水平明显升高 (P <0 .0 5 ) ,而LIF水平却明显降低 (P <0 .0 5 )。结论 :IL 1、TNF α有上调骨髓基质细胞LIF与IL 6表达 ,IL 4能上调骨髓基质细胞IL 6表达 ,却下调LIF的表达。     

人骨髓基质细胞的培养及鉴定

目的:探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法,为基因治疗提供载体细胞.方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离人骨髓进行体外培养扩增,用倒置显微镜观察细胞形态学特征并用流式细胞仪鉴定其CD90表达.结果:分离培养的骨髓基质细胞似成纤维状,原代细胞呈集落生长,并可表达CD90,传代后细胞形态较一致,且随着传代次数的增加CD90表达越高,第3代可达94.31%.结论:骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得,随着传代次数增加,纯度越高,该方法是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法.