舌癌exosomes诱导CTL细胞体外抗瘤效应的观察

目的：研究舌癌exosomes诱导CTL体外抗肿瘤效应。方法：通过连续离心及超滤法从Tca8113细胞培养上清中分离、纯化出exosomes,然后与树突状细胞（DC）共培养,诱导T淋巴细胞活化为CTL。通过乳酸脱氢酶法测定特异性CTL对Tca8113的杀伤效应。采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验。结果：exosomes可促使DC成熟。杀伤实验表明：负载exosomes的DC诱导CTL对Tca8113细胞的杀伤率显著高于未用exosomes负载的DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞,其差异有显著性（P〈0.01）。结论：Tca8113细胞来源的exosomes负载DC后,可以诱导T细胞成为抗原特异性CTL,具有特异性杀伤肿瘤细胞的功能。     

Tca8113细胞exosomes的制备、鉴定及体外抗瘤作用观察

目的:探讨舌癌Tca8113细胞能否分泌exosomes,为口腔肿瘤的免疫治疗寻找新方法。方法:采用超速离心及差异密度梯度离心等方法,从Tca8113细胞中分离并纯化exosomes,透射电镜观察其超微结构,Westernblot分析其表面蛋白成分,最后通过与树突状细胞(dendritic cells,DC)及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)等介导的细胞毒性实验来观察exosomes体外抗肿瘤效应。结果:从Tca8113细胞中成功分离并纯化出exosomes,其结构及携带蛋白与其他细胞来源的相似,并发现其分泌的exosomes还携带有肿瘤抗原MAGE蛋白。体外抗瘤实验表明:负载exosomes的DC诱导的CTL对Tca8113细胞的杀伤率明显高于未负载exosomes的DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞,有显著性差异(P<0.01)。结论:舌癌Tca8113细胞能分泌exosomes,exosomes携带各种与肿瘤免疫相关的蛋白,负载DC后,可以诱导T细胞成为抗原特异性CTL,具有特异杀伤肿瘤细胞的功能,为口腔肿瘤的免疫治疗开拓了新的途径。     

HSP70多肽复合物介导的细胞毒性T淋巴细胞对Tca8113细胞的免疫杀伤作用

目的:研究HSP70多肽(HSP70 peptide complexes,HSP70-PC)对人脾细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性及功能的影响.方法:人舌癌Tca8113细胞在43℃条件下加热30min,恢复12h后,用亲和层析方法提纯HSP70多肽,并用Western印迹鉴定;将提纯的HSP70多肽体外刺激人脾淋巴细胞扩增、活化,然后用MTT法测定其对舌癌Tca8113细胞的杀伤作用,并用电镜和相差显微镜观察其培养上清舌癌Tca8113细胞的形态学变化.采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验.结果:1g湿重的肿瘤细胞可提取纯化HSP70蛋白85μg,通过SDS-PAGE和Western印迹证实为HSP70抗原肽复合物;提取舌癌Tca8113细胞的HSP70-PC与体外免疫扩增的人脾淋巴细胞形成致敏CTL,当致敏CTL与Tca8113细胞效靶比为100:1和50:1时,致敏CTL的杀伤率分别为(77.4±2.9)%和(78.9±1.9)%,2组间无显著差异(P>0.05).HSP70诱导的CTL对Tca8113的杀伤率与非抗原刺激的淋巴细胞组比较,有显著性差异(P<0.01),受攻击的舌癌Tca8113细胞出现凋亡的形态学变化.结论:Tca8113细胞来源的HSP70多肽具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的能力,能刺激人脾淋巴细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞的效应,并能介导肿瘤细胞凋亡.     

不同方法制备抗原致敏的树突状细胞介导T淋巴细胞对Tca8113细胞杀伤作用的影响

目的探讨树突状细胞（DCs）疫苗治疗舌癌的可行性,并选择较优的抗原负载方式。方法分别采用弱酸洗脱法、反复冻融法制备Tca8113细胞抗原,并分为3组：弱酸洗脱抗原组、反复冻融抗原组、对照组（不加肿瘤抗原）。从外周血单核细胞中诱导DCs,分离出T淋巴细胞。以不同效靶比将DCs和T淋巴细胞混合培养,MTT法测光密度值,计算刺激指数。DCs抗原负载后,与T淋巴细胞混合,以不同效靶比加入预先接种了Tca8113细胞的培养板。MTT法测光密度值,计算杀伤率。结果2种方法体外成功地构建了DCs疫苗,抗原致敏组与对照组比较差异显著,且弱酸洗脱组优于反复冻融组。DCs疫苗可诱导细胞毒性T淋巴细胞有效的杀伤Tca8113细胞,并表现明显的剂量效应。结论DCs疫苗致敏T淋巴细胞能够有效的杀伤Tca8113细胞,酸洗脱抗原冲击致敏的DCs疫苗在舌癌的免疫治疗中优于冻融抗原。     

转人4-1-BBL口腔鳞状细胞癌体外诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的 构建转染人口腔鳞状细胞癌细胞株4-1-BBL基因,探讨其体外诱导抗肿瘤免疫的能力.方法 通过脂质体法将重组载体pEGFP-4-1-BBL转染人口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113,经G-418筛选及有限稀释后获得稳定高表达克隆,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测转染细胞中人4-1-BBL mRNA和蛋白的表达.制备肿瘤细胞疫苗.用淋巴细胞分离液分离纯化人外周血T淋巴细胞,用抗CD-3单抗预处理T细胞后,与转染及未转染人4-1-BBL的Tca8113疫苗混合培养.用CCK-8比色法检测细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)的杀伤活性;锥虫蓝计数法检测T细胞增殖,酶联免疫吸附实验检测培养上清液中自细胞介素(IL)-2、干扰素γ分泌水平.结果 转基因Tca8113细胞能够稳定高表达人4-1-BBL.与野生型的Tca8113细胞相比较,转染人4-1-BBL的Tca8113细胞PCR扩增产物的大小约271 bp,能够显著增强T细胞增殖,促进IL-2、干扰素γ分泌,并能有效地诱导CTL产生对Tca8113细胞的特异性杀伤作用.结论 转染4-1-BBL基因既能增强野生型Tca8113细胞的免疫原性,也能诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

低剂量环磷酰胺联合树突状细胞瘤苗对荷舌鳞癌裸鼠的治疗观察

目的：观察低剂量环磷酰胺与树突状细胞瘤苗联合应用对裸鼠体内人舌癌细胞的抑瘤作用。方法：培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC），冻融法制备Tca8113舌癌细胞可溶性抗原并体外致敏DC，将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL，联合低剂量环磷酰胺（Cy）共同接种至荷人舌癌的裸鼠。结果：抗原致敏的DC瘤苗与小剂量环磷酰胺联合后能比单用DC瘤苗更有效的治疗荷舌癌的裸鼠，与对照组相比，肿瘤生长明显抑制，生存率有显著提高（P〈0．05）。结论：以冻融抗原致敏的DC激活产生肿瘤特异性的CTL联合小剂量Cy能更有效的促进荷瘤宿主的免疫反应，具有显著的体内抑制舌癌的效果。     

Avastin联合抗原致敏的DC-CTL细胞体外抑制口腔鳞癌细胞生长的实验研究

目的:研究贝伐单抗(Bevacizumab,Avastin)与口腔鳞癌抗原致敏的树突状细胞(Dendritic Cell,DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic t Lymphocyte,CTL)联合应用,体外研究其对口腔鳞癌细胞生长的抑制作用。方法:CAL27、SCC4肿瘤细胞系的培养,检测VEGF分泌水平;培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC);冻融法制备SCC4口腔鳞癌细胞可溶性抗原并致敏DC,检测DC表面标志物变化,刺激同种异体T细胞增殖的能力及IL-12分泌水平;将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL细胞,Avastin联合CTL对SCC4细胞进行体外杀伤实验。结果:SCC4较CAL27分泌更高水平的VEGF;经肿瘤抗原致敏后的DC,其表面标志CD83、CD80、CD86、CD40及功能相关分子IL-12表达上调,CD1a的表达下调,可显著刺激异体T淋巴细胞增殖,具有统计学差异;Avastin联合CTL对SCC4的杀伤率达56.1%,显著高于对照组(P<0.05)。结论:Avastin联合DC致敏的CTL能显著抑制口腔癌细胞的生长。     

Tca8113-4-1BBL细胞联合CD28单抗在口腔鳞癌免疫治疗中的作用

目的:探讨转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28单抗体外诱导抗肿瘤活性的能力.方法:通过脂质体法将重组载体pEGFP/neo-h4-1BBL转染人舌鳞癌细胞Tca8113,经G418(400μg/mL)筛选及有限稀释后,获得稳定高表达克隆,分别用RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表达.将转染与未转染4-1BBL基因的Tea8113细胞用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗.联合抗CD28单克隆抗体与经体外抗CD3mAb诱导的人外周血T淋巴细胞共同培养,测定T细胞增殖、CTL杀伤活性及产生细胞因子(IL-2和IFN-γ)的能力.实验数据以SPSS12.0软件包进行方差分析.结果:h4-1BBL基因真核表达载体在Tca8113细胞中获得稳定表达.转染h4-1BBL基因的Tca8113细胞联合抗CD28单抗能显著刺激T细胞活化、增殖(P(0.01),促进IL-2、IFN-γ分泌(P<0.01),并能有效地诱导CTL的特异性杀伤活性(P<0.01).结论:转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28抗体能显著增强肿瘤细胞的免疫原性,诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

树突状细胞体外诱导淋巴细胞抑制舌癌细胞生长的实验研究

目的 :探讨树突状细胞 (dendriticcell,DC)通过淋巴细胞介导的免疫反应对舌癌细胞生长的影响。方法 :外周血单核细胞 ,在GM CSF IL 4的诱导下体外培养。其中一组加入TNF α ,另一组不加TNF α ;以不加任何细胞因子作为对照。用Tca8113细胞冻融抗原冲击后 ,加入自体淋巴细胞一起培养。再按 10 0∶1效靶比与Tca8113共培养 ,设未致敏淋巴细胞 Tca8113组 ,单独Tca8113组作对照。行形态学观察 ,免疫细胞化学检测DC的CD1a、CD83、HLA DR表达状况 ,MTT法检测Tca8113的存活率。结果进行统计学分析。结果 :( 1)加入TNF α组更高表达CD83 ,不加入TNF α组经肿瘤抗原刺激后 ,CD83表达急剧增加。 ( 2 )DC激活的淋巴细胞可显著抑制舌癌细胞的生长。结论 :GM CSF IL 4诱导的单核细胞来源的DC ,能体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟 ,通过激活淋巴细胞抑制舌癌细胞生长 ;TNF α能促DC成熟 ,诱发更强的抑制作用。     

致敏树突状细胞抗舌癌作用的实验研究

目的 Tca83人舌黏膜鳞状细胞癌细胞冻融抗原致敏DC.观察其对荷瘤裸鼠的押瘤作用,探讨致敏树突状细胞疫苗用于口腔癌患者免疫治疗的可行性.方法 用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)、重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)协同诱导人外周血单核细胞成为成熟DC.Tca83舌癌细胞可溶性抗原体外致敏DC,将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),共同接种至荷瘤裸鼠体内行免疫治疗.结果 人外周血单核细胞在细胞因子协同诱导下可获得功能正常的DC,用致敏Dc CTLs免疫治疗的荷瘤裸鼠与对照组相比,实验组肿瘤生长速度减慢,实验结束时(第21天)肿瘤体积明显小于对照组,明显抑制肿瘤生长(P<0.05).结论 采用舌癌细胞冻融抗原体外致教DC,诱导产生肿瘤抗原特异性CTLs具有显著的抑瘤效应,实验证明致敏Dc治疗舌鳞状细胞癌是一种有效的方法.有望成为口腔癌免疫治疗的新疗法.     

TNF-α基因转导的Tca8113细胞体外诱导DNL的细胞毒活性

目的:探讨TNF鄄α基因转导的人舌癌Tca8113细胞在体外能否诱导口腔鳞癌的引流区淋巴结细胞(DNL)而提高起其细胞毒活性。方法:体外用逆转录病毒载体将TNF鄄α基因导入Tca8113细胞并进行放射灭活,灭活的转基因细胞与来自舌鳞癌患者的DNL共培养后,采用LDH释放改良法检测诱导后DNL对未转基因Tca8113细胞的杀伤活性。结果:转基因Tca8113细胞诱导的DNL对未转基因Tca8113细胞的杀伤活性高于未经诱导的DNL。结论:TNF鄄α基因修饰的Tca8113细胞能够从肿瘤引流区淋巴结细胞中诱导出高细胞毒活性的免疫活性细胞,诱导出的免疫细胞中可能含有CTL。     

人巨噬细胞与Tca8113细胞融合瘤苗的制备及体外抗肿瘤效应

目的 探讨巨噬细胞融合瘤苗在舌癌免疫治疗中的应用。方法 利用人巨噬细胞与Tca8113细胞融合，通过磁微珠筛选出融合细胞(FC)并扩大培养，观察Fc的生物学特性及其体外诱导抗肿瘤特异性免疫的能力。结果 FC瘤苗的生长低于其亲本Tca8113细胞，流式细胞仪检测融合细胞的主要组织相容性抗原(MHC)Ⅰ、Ⅱ类分子的表达高于Tca8113，能有效刺激混合淋巴细胞反应(MLR)，并能在体外诱导淋巴细胞抑制肿瘤细胞Tca8113的生长。结论 融合细胞瘤苗能显著提高亲源舌癌细胞Tca8113的免疫原性，提示融合细胞瘤苗是一种新的抗肿瘤免疫治疗方法，可作为个体化肿瘤疫苗的新方案。     

二氢卟吩e6光动力学疗法对人舌鳞癌细胞株Tca8113的杀伤作用

目的：探讨二氢卟吩e6 （Ce6）光动力学疗法（Ce6-PDT）对体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用.方法：向体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞中加入Ce6,浓度分别为5、10、20、50和100μg/ml,孵育1.5h,予波长630nm半导体激光照射,照射的功率密度为100mW/cm2,能量密度分别为0.5、1、2、5、10和15J/cm2,继续孵育6h,用MTS比色法测定细胞存活率.结果：（1）不受光照的条件下,较低浓度Ce6（＜10μg/ml）与细胞共同培养而对细胞的毒性较小,Ce6浓度为20μg/ml时对细胞的杀伤率约为10％.（2）光照条件下,Ce6-PDT能有效地杀伤体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞,其杀伤作用与Ce6浓度及光照剂量正相关,呈浓度/剂量依赖性（P＜0.01）.结论：Ce62PDT能有效地杀伤体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞;Ce6在较大浓度下对细胞有毒性.     

Cox-2在舌鳞癌细胞Tca8113增殖机制中的作用

目的:观察并探讨Cox-2在舌鳞癌细胞(Tca8113)增殖机制中的作用。方法:通过免疫细胞化学检测Cox-2在Tca8113细胞中的表达;再通过建立裸鼠荷瘤模型及应用Cox-2特异性抑制剂(SC236)进行干预的方法,观察SC236对Tca8113细胞的增殖活性、致瘤性和成瘤速度的影响。结果:在Tca8113细胞中存在Cox-2的表达;将Tca8113细胞接种于裸鼠颈部皮下可成功诱导出组织学形态与人舌鳞癌基本一致、且表达Cox-2的移植瘤。SC236能够显著抑制Tca8113细胞及其诱导的移植瘤的生长(P<0.01),并明显延缓Tca8113细胞的成瘤速度(P<0.05)。结论:Cox-2在Tca8113细胞的增殖过程中可能发挥重要作用;Cox-2特异性抑制剂可显著抑制Tca8113细胞及其诱导的移植瘤的增殖和生长。     

半导体量子点对舌鳞状细胞癌Tca8113系生物学行为影响的研究

目的：研究新型发光纳米材料半导体量子点（semiconductor quantumdots，QD）对舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113生物学行为的影响。方法：用不同浓度最大发射波长为605nm的QD与Tca8113共培养，观察QD对Tca8113细胞生长的影响。用QD标记Tca8113细胞（Tca8113-QD），利用transwell小室法和冲刷实验，观察Tca8113-QD细胞侵袭、黏附和趋化运动能力的变化。结果：Tca8113细胞与不同浓度QD共培养后，其细胞的生长曲线基本一致，差异无统计学意义。Tca8113-QD细胞和Tca8113细胞的侵袭、黏附和趋化运动能力差异无统计学意义。结论：用QD标记Tca8113细胞后，不影响肿瘤细胞生长、侵袭和转移能力，为半导体量子点在活体生理条件下用于肿瘤细胞和细胞内分子成像及示踪研究提供了科学依据。