淋病奈瑟菌标准株外膜蛋白NspA基因重组质粒构建和生物信息分析

[目的]研究淋病奈瑟菌标准株(NG 29403和NG 29400)外膜蛋白NspA基因和NspA融合蛋白结构特点,为淋病奈瑟菌疫苗靶蛋白的选择提供依据。[方法]PCR扩增淋病奈瑟菌标准株NG 29400和NG 29403 NspA基因,与表达质粒pET-30c(g )构建重组子NspA-pET-30c( ),阳性克隆子经双酶切鉴定后进行基因测序。以生物软件对NspA基因进行生物信息分析,并在线预测其蛋白质结构。[结果]成功构建NspA-pET-30c( )重组质粒,双酶切获得0.5kb和5.4kb预期产物。基因序列分析表明淋病奈瑟菌NspA基因有较高同源性,两标准株与GenBank已有序列均有98%同源性,且与脑膜炎奈瑟菌NspA基因高度近似。蛋白预测显示NspA融合蛋白有40%以上为环状结构,可能为主要功能区。三级结构与脑膜炎奈瑟菌NspA相似。[结论]淋病奈瑟菌NspA基因具有高度保守性,与脑膜炎奈瑟菌NspA基因同源性高,蛋白结构相似,有望成为淋病奈瑟菌疫苗的候选抗原。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因原核表达系统的构建及序列分析

目的：分析比较5株临床分离的淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因核苷酸及氨基酸序列，构建PIA基因的原核表达系统。方法：采用高保真PCR扩增5株淋病奈瑟菌全长PIA基因序列，T—A克隆后测序并与已发表的序列进行比较，用Wonderful分子生物学软件分析基因和蛋白质序列的相似性。再构建PIA原核表达系统，不同浓度IPTG诱导后，10％SDS—PAGE检测蛋白表达情况。结果：5株PIA淋病奈瑟菌均为IA6血清型。与报道的PIA基因序列（No：L19962）比较，核苷酸和氨基酸序列相似性均分别高达99．47％-100％和99．04％-100％。构建的原核表达系统pET42-PIA—Ecoli BL21DE3表达的重组蛋白PIA量占细菌总蛋白量的49．6％。结论：IA6为PIA菌株优势血清型，核苷酸和氨基酸序列相似性高，已成功构建淋病奈瑟菌PIA基因高效原核表达系统，为淋病奈瑟菌基因疫苗和临床检测试剂盒的研制打下基础。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析

目的 获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因(porB)并构建其重组表达质粒。方法 根据porB已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出porB基因片段，克隆到原核表达质粒pQE30中，转化大肠埃希菌M15感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果 porB基因体外扩增产物大小约为911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因，为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础：     

淋病奈瑟菌主要外膜蛋白DNA疫苗的构建及免疫效果观察

目的克隆淋病奈瑟菌孔蛋白IB型（PIB）基因并构建其真核表达载体pCI-PIB,了解pCI-PIB免疫接种后诱导小鼠特异性体液和细胞免疫反应的效果。方法采用聚合酶联反应（PCR）扩增淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PIB全长基因片段（960bp）,构建表达PIB的真核表达载体pCI-PIB。pCI-PIB肌内注射免疫BALB／c小鼠65只,100μg/次／只,亲和素-生物素-过氧化酶复合物（ABC）法检测其中10只pCI-PIB免疫小鼠肌细胞中PIB的表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）和特异性淋巴细胞增殖反应（MTT）法检测余下pCI-PIB免疫小鼠的特异性体液和细胞免疫应答效果。采用玻片凝集试验和补体溶菌试验检测pCI-PIB免疫小鼠血清的抗菌活性。结果PCR可扩增出预期大小的全长PIB基因片段（960bp）,与报道PIB基因序列（GenBank No：AF090801）比较,重组质粒pCI-PIB中目的插入片段的核苷酸序列同源性可达99．28％。免疫小鼠的肌细胞能摄取pCI-PIB并表达PIB。pCI-PIB免疫小鼠的血清中可产生较高效价的特异性IgG（1：4000）,并产生特异性T细胞增殖反应,增殖指数（4．031）明显高于对照组（1．127）（t=71．71,P〈0．05）。pCI-PIB免疫小鼠血清及阴道冲洗液均有凝集淋病奈瑟菌的作用,在补体参与下可杀灭细菌。结论本研究成功地构建了淋病奈瑟菌PIB基因重组真核表达载体pCI-PIB。pCI-PIB接种小鼠后可有效地引起特异性体液和细胞免疫反应,具有作为淋病奈瑟菌候选DNA疫苗的应用前景。     

人SIK2重组质粒的构建和真核细胞转染

目的 构建人SIK2基因真核表达载体.方法 利用PCR扩增目的基因SIK2,PCR产物经纯化后与pC-MV-Tag 2B线性质粒进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂卡那抗性琼脂糖平板;菌落PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆后,抽提质粒,利用Lipofectamnie 2000TM试剂瞬转293T细胞,24 h后,Western Blot方法检测其在真核细胞内的表达.结果 成功构建pCMV Tag-2B-SIK2重组质粒,并在真核细胞内成功表达.结论 SIK2外源表达载体的构建成功,为进一步研究其功能奠定了实验基础.     

多种菌外膜蛋白诱导新IgAN模型的肾肝脾病理组织学分析

目的分析三种IgA肾病模型所造成的肾肝脾损伤并加以比较,以从中选出一种理想的IsA肾病模型,并为今后模型的药物治疗提供指导依据。方法用HE染色,刚果红染色,偏振光显微镜观察金葡菌组、葡聚糖组和大肠杆菌外膜蛋白组肾肝脾的病理学改变。结果大肠杆菌外膜蛋白组肾小球的系膜细胞和系膜基质无增生等改变,肝脾损伤严重,部分可见粉红物质沉积。葡聚糖组个别肾小球的系膜细胞局灶性的轻度增生,肝脾血管内粉染物质沉积严重。金葡菌组多数肾小球系膜细胞和系膜基质不同程度的增生,肝肾损伤轻。结论金葡菌组更接近于人的IgA肾病,造模效果优于大肠杆菌外膜蛋白和葡聚糖。     

阪崎肠杆菌外膜蛋白基因的克隆与序列分析

目的:扩增并分析阪崎肠杆菌外膜蛋白基因。方法:根据肠杆菌外膜蛋白A基因的序列特点,设计引物,扩增阪崎肠杆菌外膜蛋白A(ompA)序列,并通过T载体克隆后测序。结果:序列分析表明其1044 bp的序列全长编码347个氨基酸,具有肠杆菌科细菌外膜蛋白序列的典型特征。同源性分析表明,该序列与其它肠杆菌属细菌的序列进行比较,其核酸序列同源性为86%到99%。结论:结果表明该序列为阪崎肠杆菌外膜蛋白基因。     

基于淋病奈瑟菌外膜蛋白pIA-pIB融合基因重组产物酶联免疫吸附试验的建立和应用

2005年6月天津市武清区汊沽港镇发生以发热、腹泻、恶心、呕吐和脓血便为主要症状的病例,共确诊患者1189例,经流行病学调查确认是一起由于生活饮用水源污染而导致的福氏志贺痢疾杆菌3a型细菌性痢疾(菌痢)的暴发.     

上海市浦东地区淋病奈瑟菌分型与耐药性的相关分析

目的了解上海市浦东地区淋病病原体奈瑟双球菌的不同基因分型及各基因型与耐药性之间的对应关系。方法运用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹图谱对78株分离自不同患者淋球菌菌株进行区分，从分子水平对淋球菌进行基因分型，并在此基础上探讨不同的基因分型与耐药性之间的关系。结果78株淋球菌分离株RAPD图谱上相似，但各菌株基因图谱之间有明显不同DNA多态性，可将菌株区分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种基因分型，对此三种基因分型与A、B、C、D四种不同的耐药类型进行对应分析，发现耐药类型与基因型别之间存在对应关系。结论通过研究发现浦东地区淋球菌流行株有着不同的耐药特点及基因型别，耐药性与不同的基因分型之间存在着一定相关性。     

嗜肺军团菌重组蛋白momp-Linker-pip的重组质粒构建及鉴定

目的 利用自带Linker的引物,重组嗜肺军团菌pip和momp基因,构建其重组质粒pET-MLP,以获得其原核细胞表达产物并进行鉴定。方法 首先制备足量的pET-pip、pET-momp以及空质粒pET-32a（+）;通过PCR扩增pip、momp基因,将其定向克隆至pET-32a（+）并进行纯化筛选和鉴定;最后利用含有Linker的引物,将重组质粒pET-pip和pET-momp基因进行连接,完成pET-MLP的构建、筛选和鉴定。结果 利用PCR、限制性核酸酶切电泳进行结果鉴定,于NCBI中将重组质粒的核酸序列与LP1型军团菌的相应序列对比,结果表明其同源性达到98%。结论 实验成功构建、表达了重组质粒pET-MLP,为下一步以重组蛋白MLP作为诊断抗原进行嗜肺军团菌血清学检测奠定了基础。     

基于淋病奈瑟菌外膜蛋白pIA-pIB融合基因重组产物酶联免疫吸附试验的建立和应用

目的 克隆淋病奈瑟菌外膜蛋白pIA、pIB基因并构建pIA-pIB融合基因及其原核表达系统以及建立基于rPIA-PIB的酶联免疫吸附试验(ELISA).方法 采用连接引物PCR构建pIA-pIB融合基因,按常规分子生物学方法构建其原核表达系统.采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和BioRad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rPIA-PIB表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rPIA-PIB.以rPIA-PIB为包被抗原建立检测淋病患者血清标本中rPIA和/或rPIB特异性IgG的ELISA,以rPIA-PIB抗血清为一抗建立检测淋病患者脓液标本中rPIA和/或rPIB的ELISA,实验中以rPIA、rPIB及其抗血清相关ELISA为对照.结果 pIA-pIB融合基因与原始核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rPIA-PIB表达量为细菌总蛋白的29.8%,其提纯物SDS-PAGE后显示单一条带.rPIA-PIB-IgG-ELISA检测119例淋病患者血清标本的阳性率(98.3%)明显高于rPIA-IgG-ELISA(30.3%)或rPIB-IgG-ELISA(66.4%)(P＜0.01).rPIA-PIB-ELISA检测119例淋病患者脓液标本的阳性率(91.6%)也明显高于rPIA-IgG-ELISA(27.7%)或rPIB-IgG-ELISA(62.2%)(P＜0.01).结论 成功构建淋病奈瑟菌pIA-pIB融合基因及其原核表达系统;较之单一的rPIA或rPIB,rPIA-PIB作为淋病相关检测试剂盒抗原具有明显的优越性.     

奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因的克隆、真核表达与鉴定

目的克隆奈瑟氏淋球菌外膜蛋白PIA基因,构建稳定的真核重组表达载体,并在HELA细胞中表达。方法根据淋球菌PIA基因序列,利用Primer Premier5.0生物学软件设计一对特异性扩增引物,以淋球菌国际标准株基因组DNA为模板,PCR扩增除掉信号肽后PIA基因开放读码框（ORF）,将其插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建含目的基因的pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒,PCR及酶切鉴定重组载体,脂质体转染HELA细胞,以间接免疫荧光法检测PIA基因在HELA细胞中的表达。结果成功构建了pcDNA3.1（＋）/PIA重组质粒;pcDNA3.1（＋）/PIA能在HELA细胞中高效表达PIA蛋白。结论重组质粒pcDNA3.1（＋）/PIA构建成功并在HELA细胞中高效表达了PIA蛋白,为该蛋白的抗原性及功能学研究奠定了基础。     

甲型副伤寒杆菌外膜蛋白X基因分布及其重组表达产物免疫保护作用的研究

目的 了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株外膜蛋白(omPX)基因分布、序列保守性及其产物免疫原性和免疫保护性。方法 采用PCR扩增甲型副伤寒沙门菌临床菌株omPX基因。利用大肠埃希菌表达系统表达rOmPX,产物采用Ni.NTA亲和层析法提纯。采用免疫扩散法、ELISA和Westem blot鉴定rOmPX抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rOmPX对甲型副伤寒沙门菌感染的免疫保护作用,微量肥达试验检测rOmPX免疫小鼠血清抗体凝集伤寒和副伤寒沙门菌效价。结果 所有甲型副伤寒沙门菌临床菌株均有。御x基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.2%-100.0%和98.4%,100.o%。rOmP>X免疫家兔可产生高效价抗体,利用该抗体与甲型副伤寒患者血清标本进行ELISA试验,95.6%(65/68)的标本呈阳性。100嵋和200雌rOmPX对感染小鼠的免疫保护率分别为93.3%(14/15)和100.0%(15/15)。rOmPX免疫小鼠血清对甲型副伤寒和伤寒沙门菌H抗原凝集效价为l：10～l：40。结论 omPX基因重组表达产物可作为甲型副伤寒沙门菌基因工程疫苗候选抗原。     

幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌(H. pylori) NCTC11637菌株36kDa (OMP36)外膜蛋白基因原核表达系统,探索研制H. pylori疫苗的新途径.[方法]培养和收集H. pylori NCTC11637菌株,提取基因组DNA, PCR扩增目的基因片断.将其克隆到T载体并测序,再将目的基因克隆入PET32a( ),构建重组表达载体PET32a-OMP36.转化E.coliBL21后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白.(结果)测序分析表明,插入的基因片断为987bp,表达的蛋白的相对分子质量(Mr)约为36kDa,并显示具有良好的抗原性.SDS-PAGE检测表明,表达量占细菌总蛋白的37%,镍亲和层析纯化率约92%.Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性.[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP 36kDa的编码基因,其表达产物OMP 36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H. pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础.     

空肠/结肠弯曲菌的生物分型和质粒分析及其在流行病学中的初步应用

本文对来自成都地区的弯曲菌进行了生物分型和质粒分析,并结合血清学分型应用于弯曲菌肠炎病人家庭的调查。116株弯曲菌中,空肠弯曲菌生物1型、生物2型和结肠弯曲菌分别占58.6%、4.3%和37.1%;人源菌和鸡源菌均以空肠弯曲菌生物1型为主,猪源菌主要为结肠弯曲菌。弯曲菌质粒检出率为18.9%,检出的质粒株中,大多含2~3个质粒带,分子量﹤1.4~58×10⁶道尔顿;结肠弯曲菌的质粒检出率(34.21%)明显高于空肠弯曲菌(10.29%)。两个病家的调查结果说明:生物分型和质粒分析在追踪弯曲菌感染的传播中具有一定价值,可以作为弯曲菌感染流行病学调查的有用工具。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprⅠ基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprⅠ基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量.方法以铜绿假单胞菌的oprⅠ基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中.用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性.根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量.结果铜绿假单胞菌oprⅠ基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增.结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprⅠ基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌.     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-LasR的构建及在大肠埃希菌中的表达效率

目的:构建铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-LasR,并在大肠埃希菌中研究其表达效率。方法:提取铜绿假单胞菌PA01株DNA,PCR扩增 lasR基因,并将其与pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-LasR。将pGEX-LasR转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,筛选阳性克隆,提取质粒进行PCR和双酶切鉴...     

环丙沙星—Tienam交叉耐药绿脓假单胞菌外膜蛋白的SDS—PAGE分析

经环丙沙星（ＣＰＬＸ）次抑菌浓度肉汤传代培养筛选到的５株ＣＰＬＸ－Ｔｉｅｎａｍ交叉耐药绿脓假单胞菌，随机选取其中３株，提取外膜蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，并以ＣＰＬＸ传代培养前３株原株作为对照。结果显示两者的外膜蛋白谱没有显著的区别。绿脓假单胞菌对ＰＬＸ－Ｔｉｅｎａｍ交叉耐药的机理可能涉及外膜蛋白以外其它影响膜透性有关的因素。     

肺炎衣原体主要外膜蛋白重组抗原制备与应用的研究

目的：为了研究肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae,Cpn）抗原作为特异性诊断试剂,本文应用重组技术研制Cpn主要外膜蛋白（major outer membrane protein,MOMP）重组抗原,用于血清IgG抗体的检测。方法：通过构建和表达CpnMOMP重组抗原,应用包涵体纯化法纯化重组抗原后建立ELISA试验,并检测了82份正常人血清及临床标本207份,其中心血管疾病血清118份,呼吸系统疾病血清59份,其他疾病30份。结果：应用克隆技术,获得纯化的Cpn MOMP重组抗原。用重组抗原检测血清IgG,正常人血清阳性检出率仅为3.7%;而207份病人血清,116份为阳性,总阳性率56.0%。其中心血管疾病血清118份,阳性69份,阳性率58.5%;呼吸系统疾病血清59份,阳性38份,阳性率64.4%;其他疾病患者30份,阳性9份,阳性率仅30.0%。结论：与进口ELISA试剂盒相比阳性率基本相符,统计分析无显著意义,但重组MOMP蛋白的抗原特异性较高,且具有抗原制备较为方便和价廉等特点。由于临床标本数量有限,尚需进一步探索MOMP重组抗原作为Cpn感染疾病的辅助诊断。     

淋病奈瑟菌孔蛋白PIA真核表达系统的构建及序列分析

目的:构建淋病奈瑟菌孔蛋白PIA(Porin IA)基因的真核表达系统,为淋病DNA疫苗的研究提供材料。方法:PCR技术扩增淋病奈瑟菌捷克标准株的PIA基因片段,将其定向插入真核表达载体pC I-neo多克隆位点中,构建重组表达载体。并用酶切分析、PCR扩增及序列测定方法,对重组载体进行鉴定。结果:淋病奈瑟菌PIA基因被正确克隆到真核表达载体pC I-neo中,测序结果与Genebank中AF090819等菌株序列有99.99%同源性。结论:真核表达系统(pC I-PIA)构建成功。