弓形虫表面抗原P35基因片段的表达纯化和抗原性分析

目的制备具有免疫活性的弓形虫表面抗原P35基因片段的重组蛋白,并对其抗原性进行分析。方法根据弓形虫RH株表面抗原P35的cDNA序列设计一对引物,利用PCR技术从RH株弓形虫基因组中扩增出P35的基因片段,将其克隆到T载体中,并通过基因测序加以证实;将其亚克隆至原核表达载体pET KDO中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。采用免疫印迹法对表达产物进行抗原性分析。结果从弓形虫RH株基因组中成功扩增到P35目的基因,该基因在原核系统中经诱导表达出分子量约42 000 Da大小的融合蛋白,经免疫印迹实验表明,表达产物具有良好的抗原性,经亲和层析纯化后得到了重组蛋白。结论运用基因工程技术得到了高纯度并具有良好抗原性的弓形虫重组P35融合蛋白。     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的原核细胞表达及其抗原性分析

目的构建弓形虫GJS株表面抗原1（SAG1）重组表达质粒,研究SAG1蛋白疫苗诱导的保护性免疫作用。方法根据RH株弓形虫SAG1基因序列设计1对引物,利用PCR方法获得SAG1基因,克隆入pMD18-T载体,测序后进行序列分析;重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-30a中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达;重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,ELISA法测定其抗体滴度的变化,并用弓形虫速殖子攻击检测免疫保护力。结果与已知的SAG1基因核苷酸序列（$76248）及其编码氯基酸序列的同源性分别为99％、97％;表达的SAG1蛋白以包涵体形式存在,该重组抗原能被羊抗弓形虫阳性血清所识别;经间接ELISA检测,小鼠免疫后产生了较高的抗体;动物保护性实验表明,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论成功构建了弓形虫SAG1重组表达质粒,SAG1蛋白疫苗诱导小鼠的免疫保护力不强。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的 亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因，构建表达质粒pBK/P22，并对其在大肠杆菌（E.coli)中的表达作初步研究。方法 以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，在以低熔点琼脂糖回收纯化后，插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点，构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导在E.coliDH5α中表达，表达产物以SDS－PAGE与免疫印迹分析。要双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得约593bp的P22码基因片段，与预期片段大小相符；所构建pBK/P22重组性体阳性克隆以双酶切和PCR鉴定与预期结果一致；SDS－PAGE与免疫印迹显示，表达产物的大小约28ku。结论 成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒，诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白，为抗原免疫特性的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的　扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法　设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果　从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论　GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。     

弓形虫RH株ROP1抗原基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中高效表达ROP1抗原。方法 采用聚合酶链反应（PCR）从弓形虫RH株cDNA文库中扩增得到编码ROP1的基因,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3,然后在大杆菌BL21中进行表达,用亲和层析柱纯化表达产物,并用SDS－PAGE和Western blotting进行鉴定。结果 （1）在我们比较的1249个碱基中,我们得到的ROP1基因在Ossorio报道的基因的447位与448位之间有一96bp的插入片段,另有14个碱基不同,造成3个氨基酸的改变,两基因之间有91.19%的同源性,（2）得到一分子量约为70kDa的融合蛋白。结论 1,我们获得了一与Ossorio报道的基因有较大差异的rop1基因（GeneBank登录号：AF350261）（2）,ROP1基因在大肠杆菌中得到了ROP1融合蛋白的高效表达。     

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。     

弓形虫表面抗原SAG3基因的克隆与表达

目的克隆表达弓形虫RH株SAG3基因,为深入研究其结构及功能奠定基础。方法从弓形虫RH株基因组DNA中特异性扩增出编码SAG3基因的片段,相应酶切后克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建pET-SAG3重组质粒。将pET30-SAG3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经EcoRⅠ、Hind III酶切及测序鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。结果体外扩增的SAG3基因片段与目的片段大小相符约1 155bp,成功构建了重组表达质粒pET30-SAG3,SDS-PAGE、Western blot显示SAG3-His融合蛋白的分子量大小约为50kd。结论弓形虫表面抗原SAG3基因在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究SAG3的结构和功能奠定基础。     

弓形虫主要表面抗原基因（P30）大肠杆菌中以融合蛋白形 …

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（Ｐ３０）的基因的序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出Ｐ３０基因,将Ｐ３０基因克隆入表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,宿主菌经ＩＰＴＧ诱导表达后,产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析。结果显示,Ｐ３０基因以融合蛋白的形式表达,实物具有特异的免疫反应性。     

弓形虫膜表面抗原SAG1基因的原核表达及重组蛋白的免疫诊断价值

目的 探讨重组弓形虫膜表面抗原SAG1基因的表达产物-原核表达蛋白(rSAG1)用于弓形虫病的免疫诊断价值.方法 用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌重组质粒pET28a-SAG1(pET28a-SAG1/BL21)表达,纯化重组pET28a-SAG1/BL21弓形虫膜表面抗原SAG1基因表达产物;用弓形虫缓殖子感染的鼠血清、正常鼠血清和10例弓形虫患者血清为一抗,基因表达产物rSAG1用免疫印迹法进行鉴定,比较rSAG1在弓形虫病免疫诊断中的价值.结果 纯化重组弓形虫膜表面抗原SAG1基因后获得了相对分子质量约38.5×103的表达产物rSAG1;表面抗原SAG1可被弓形虫缓殖子感染的鼠血清所识别;10例弓形虫患者血清在免疫印迹诊断中,有4例出现了弓形虫膜表面抗原SAG1基因表达产物rSAG1.结论 rSAG1具备一定的弓形虫病的免疫诊断价值.

Abstract：

Objective To investigate the diagnostic value of the recombinant surface antigen 1 (rSAG1) in immunodiagnosis of toxoplasmosis. Methods Isopropyl β-D- 1 -thio-galaetopyranoside (IPTG) was used to induce the expression of recombinant plasmid pET28a-SAG1 of Escherich coli(pET28a-SAG1/BL21 ). The expression products (rSAG1) of pET28a-SAG1/BL21 were identified by Western blotting. The serum of mice infected with Toxoplasma gondii tachyzoites, normal mouse serum and the serum from 10 toxoplasma gondii patients were used as primary anti-Toxoplasma gondii antibodies, and the rSAG1 gene products were identified by Western blotting, by which the diagnostic value of rSAG1 in Toxoplasmosis was compared. Results After induction and purification, rSAG1 protein was obtained and its relative molecular mass was 38.5 × 103. The fusion protein could be recognized by the serum of mouse infected with Toxoplasma gondii tachyzoites, rSAG1 of expression products of surface membrane antigen SAG1 gene from Toxoplasma Gondii could be detected in 4 cases from 10 patients by Westem blotting.Conclusion The rSAG1 has a potential value in the immunodiagnosis of Toxoplasmosis.     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆、表达与鉴定

目的 对刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶基因（NTPase）进行克隆、表达和鉴定。 方法 采用PCR扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM?-T Easy载体，经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB，并转入大肠埃希菌(E.coli)BL21（DE3）中进行诱导表达。用镍-次氮基三乙酸亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析蛋白表达产物。 结果 PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列，经测序鉴定无基因突变。SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达，其融合蛋白相对分子质量（Mr）约70 000，与理论值相近。Western blotting分析结果显示，纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清识别。 结论 所克隆表达的弓形虫NTPase-Ⅱ重组蛋白具有良好的抗原性。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的 克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法 诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。 结果 从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690 bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4％,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6％（P＜0.05）。 结论 原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。     

抗弓形虫主要外膜蛋白单克隆抗体的分析与鉴定

用杂交瘤技术制备抗弓形虫单克隆抗体，经蛋白印迹试验证实：12A10、12C4杂交瘤株分泌抗弓形虫主要外膜蛋白P30的单克隆抗体。其免疫球蛋白均为IgG类。     

弓形虫主要抗原基因（SAG1）在昆虫细胞中表达的研究

用PCR技术从弓形虫DNA扩增出一段长约902bp编码弓形央主要膜蛋白抗原（SAG1）的基因，将SAG1基因插入带有转座子供体的pFastBacl质粒，得到重组质粒pFT9，pFT9转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，通过转座重组作用使SAG1基因整合到杆状病毒载体上，将两株转座重组子BaC101和Bac304DNA分别转染Sf9昆虫细胞，用弓形虫免疫血清所作的免疫印迹试验证实这两株重组杆状病毒的昆虫细胞株均表达了SAG1蛋白。本文首次报告弓形虫SAG1蛋白在昆虫细胞中的表达。     

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的?摇分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7（dense granule protein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。 方法 从弓形虫不同分离株（RH株、ZS2株和GT株）的基因组中特异地扩增出GRA7基因，将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达，对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶（GST）抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western blotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，ELISA 法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。 结果 弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同；pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白，Western blotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白，且能被人抗弓形虫阳性血清所识别；ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。 结论 弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性；GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达，且该重组蛋白具有一定免疫反应性。     

乳酸乳球菌表达弓形虫棒状体蛋白1(ROP1)

目的　在乳酸乳球菌中表达ROP1抗原蛋白。方法　从质粒 psk -ROP1中以BamHⅠ和SalⅠ双酶切出ROP1基因 ,置换构建好的大肠杆菌 -乳酸乳球菌穿梭表达质粒L2 -PsP30T中的P30基因 ,电转化感受态乳酸乳球菌 ,以Westernblotting鉴定ROP1在乳酸乳球菌中的表达。结果　表达产物中有一约 4 3kDa的蛋白带能被弓形虫病人血清识别。结论　ROP1在乳酸乳球菌中得到了表达